【抗体偶联药物/ADC】筛选与鉴定工具

为什么研究抗体偶联药物？

抗体偶联药物 (Antibody Drug Conjugates, ADCs) 彻底改变了靶向疗法，特别是在癌症和其他复杂疾病治疗领域。靶向疗法的概念可以追溯到 1906 年，当时 Paul Ehrlich 提出了“魔法子弹”——将药物直接靶向疾病部位。20 世纪 70 年代，随着杂交瘤技术的发展，该领域取得了重大进展，实现了单克隆抗体的大规模生产。从那时起，抗体就被用在免疫细胞招募、特异表位阻断，并将细胞毒性药物直接递送到靶细胞，从而显著拓宽了治疗窗并降低了毒性。

自从2000年首个ADC药物获批以来，ADC市场呈现爆发式增长，因此高效ADC筛选和鉴定工具对加速疗法开发的重要性也日益增大。

赛默飞开发了一系列创新型ADC研究工具，可实现高通量筛选和鉴定，适用于多种样品类型，同时兼容各个平台，包括流式细胞术、高内涵成像和活细胞成像系统。本文梳理了以下四个维度的ADC研究高效工具：

表1. ADC筛选和鉴定工具汇总

01 抗体结合筛选工具

为什么从抗体结合筛选开始？

ADC 开发的初始步骤之一是筛选抗体结合，以确保抗体能够特异性识别并结合细胞表面的靶抗原。这一点至关重要，因为 ADC 的有效性取决于其选择性结合癌症细胞的同时不伤害健康细胞的能力。从抗体结合开始有助于识别对靶抗原具有高特异性和亲和力的候选药物，为后续的内化和降解步骤奠定基础。

用于抗体结合筛选的 Zenon 试剂

Invitrogen™ Zenon™ Alexa Fluor™ Plus 标记试剂是与荧光染料结合的 Fab 片段，可快速高效地筛选抗体结合。这些试剂旨在特异性地结合抗体的 Fc 区域，提供强大的信号，可使用常规成像、高内涵筛选或流式细胞术平台轻松检测。Zenon Alexa Fluor Plus IgG 标记试剂将快速且高通量的 Zenon 技术与卓越的 Alexa Fluor Plus 染料相结合，提供更高的灵敏度和一致性，使其成为筛选大量候选抗体库的理想选择。

Invitrogen™ Zenon™ Alexa Fluor™ Plus试剂核心优势：

快速——5分钟抗体孵育
简便——无需纯化
高信噪比
适用于多种 IgG 亚类

图 1. Her-2 阳性 SKBR3 细胞用 Zenon Alexa Fluor Plus 标记试剂标记（货号举例：Z25619）的曲妥珠单抗在 37℃和 5% CO₂下处理 30 分钟。用 1x PBS 清洗细胞 3 次，然后使用 Thermo Scientific™ CellInsight™ CX7 Pro 高内涵成像平台进行成像。阴性对照：将细胞与不含曲妥珠单抗的 Zenon 试剂一起孵育。

图 2 使用 Zenon Alexa Fluor Plus 647 Human IgG 标记试剂标记 24 种候选抗体，每种抗体重设置三个复孔。HER2阳性SKBR3 细胞与标记抗体共孵育 24 小时，用 Hoechst 标记并在 Thermo Scientific™ CellInsight™ CX7 Pro 平台上进行分析。

02 ADC内化检测工具

为什么检测ADC内化？

一旦确定了抗体的结合特异性，下一个关键步骤就是筛选ADC的内化。ADC 通过内化到靶细胞中、细胞毒性药物在靶细胞中释放出来发挥治疗作用。筛选内化可确保抗体能够有效进入靶细胞，这对于细胞毒性药物的递送至关重要。此步骤有助于识别既能与靶抗原结合还能被有效内吞作用的候选ADC。

检测 ADC 内化的pH 依赖性探针

Invitrogen™ pHrodo™ 试剂盒和试剂采用 pH 敏感技术，使研究人员能够高度特异性地研究胞吞作用或吞噬作用。pHrodo 染料有红色、绿色和深红色三色可供选择，在细胞外环境的中性 pH 下不发荧光。只有当内化到内体或溶酶体的酸性环境中时，pH 敏感染料才会发出明亮的荧光。通过将这些染料与 ADC 结合，研究人员可以使用活细胞成像或流式细胞术可视化和量化内化过程，且无需任何清洗步骤。内化的实时监测为 ADC 开发提供了关键信息，确保治疗胞毒药物有效地递送到靶细胞。

Invitrogen pHrodo 染料的 pH 敏感技术可与其他标记技术相结合。这些技术包括用于与暴露的赖氨酸残基结合的胺反应性染料、使用 SiteClick 抗体标记试剂盒的位点特异性标记以及快速 Zenon 抗体标记方法，以满足您特定的内化检测需求。

Invitrogen™ pHrodo™ 试剂核心优势：

信号强：在酸性 pH 下发出明亮荧光
背景低：在中性 pH 下信号极低
适用于与抗体和配体结合

图 3. pHrodo Deep Red 在晚期内体和溶酶体中（pH 值5.5-6.0）发出荧光。用 pHrodo Deep Red （货号：P35355）标记的赫赛汀处理SKBR3 细胞，随后成像：晚期内体和溶酶体中有荧光，但在早期内体中无荧光。此实验证实了 pHrodo Deep Red 仅在酸性条件下活化。

快速检测ADC内化的Zenon pHrodo 试剂

Invitrogen™ Zenon™ pHrodo™ 试剂是一种非常快速标记 IgG 抗体的方法，可用于检测ADC内化。Zenon 标记过程包括将目标一抗与 pHrodo 偶联的 Zenon fab 片段一起孵育，在 5 分钟内形成抗体复合物。这种非共价相互作用足够稳定，可以检测细胞内的内化和运输。标记后的抗体可用于各种应用，包括活细胞成像和流式细胞术，为抗体内化动力学提供有价值的见解。

Zenon pHrodo 试剂核心优势：

快速——5 分钟完成标记
稳定——非共价但稳定的相互作用
保留抗体功能——特定于 Fc 部分，保留抗原结合位点

图 4. 用 Zenon pHrodo Deep Red （货号Z25618）标记的曲妥珠单抗或 Zenon pHrodo Deep Red （货号Z25622）标记的抗转铁蛋白受体处理SKBR3 细胞 16 小时，以使单抗或受体完全内化。在成像之前，用 50 nM Invitrogen LysoTracker Red 处理细胞 1 小时。使用 RFP 和 Cy5 滤光片在 Invitrogen EVOS M7000 成像系统上成像。

03 监测ADC溶酶体降解的工具

为什么要监测溶酶体降解？

确保抗体与靶抗原结合并有效内化后，下一步是监测溶酶体降解。这一点至关重要，因为 ADC 的治疗效果取决于溶酶体内细胞毒性药物的释放。监测溶酶体降解可确认内化的 ADC 被运送到溶酶体，药物在那里被释放以发挥治疗作用。此步骤有助于识别内吞后到达溶酶体释放药物的抗体。

用于监测溶酶体降解LysoLight 试剂

Invitrogen™ LysoLight™ 抗体标记试剂盒和活性染料是监测溶酶体内 ADC 分解代谢的有力工具。与 pH依赖的 pHrodo 技术不同，LysoLight 偶联抗体或蛋白质即使在晚期内体中也不会发出荧光，只有在被溶酶体蛋白酶裂解时才会发出荧光。这种机制提供了卓越的灵敏度和特异性，用以精准检测蛋白质或 ADC 的内化和运输。使用 LysoLight 技术，研究人员还可以评估靶向蛋白质降解候选分子对分解代谢或循环途径的倾向。这可以帮助靶向蛋白质降解领域的研究人员微调他们的候选物以获得最大的治疗潜力。LysoLight 试剂盒和试剂与多种平台兼容，例如流式细胞术、高内涵成像和活细胞分析系统。

LysoLight 试剂核心优势：

无背景：在溶酶体中裂解前不发荧光
兼容各种成像和流式细胞术平台
兼容类器官和类肿瘤等 3D 模型

图 5. LysoLight 染料是用于直接监测目标蛋白溶酶体降解的高效工具。在未裂解形式下，LysoLight Deep Red 或 LysoLight Green 没有背景荧光。只有被溶酶体内的蛋白酶 B 裂解后，染料才会变成荧光，从而分别导致 Cy5 或 GPF/FITC 通道中出现明亮的荧光。

图 6 LysoLight Deep Red （货号L36001）或 LysoLight green （货号L36005）与西妥昔单抗（或同种型对照）结合，并与 EGFR+ 人肺肿瘤球状体（HuLu051421）一起孵育 16 小时。接下来用 Hoechst 复染肿瘤球状体细胞，并在共聚焦显微镜上成像。

04 使用位点特异性标记优化您的 ADC

为什么要使用位点特异性标记？

确认结合、内化和溶酶体降解后，最后一步是优化抗体标记过程，以确保一致且可重复的结果。优化涉及微调标记条件以达到所需的DOL (Degree of Labeling)，同时保留抗原结合位点并维持抗体功能。此步骤对于生产高质量 ADC 至关重要。

用于可重复、位点特异性标记的 SiteClick 试剂

Invitrogen™ SiteClick™ 抗体标记技术可实现荧光染料或毒素的位点特异性结合，确保抗体 Fc 部分的标记一致。Invitrogen SiteClick 抗体叠氮修饰试剂盒使用酶通过叠氮部分特异性修饰抗体的碳水化合物结构域。通过无铜点击化学，多种 sDIBO 或 DBCO 炔烃标记物可在孵育步骤进行结合。例如，将 pHrodo Red sDIBO通过点击化学反应加到叠氮修饰的曲妥珠单抗上，以评估 SKBR3 球状体中的内化情况（图8）

SiteClick 试剂核心优势：

位点特异性结合
稳定：DOL一致
保留抗体功能：保留抗原结合位点以维持抗体功能

图7. SiteClick 修饰试剂盒采用位点特异性法，利用β-半乳糖苷酶和β-1,4-半乳糖基转移酶修饰碳水化合物结构域，然后将叠氮化物修饰的糖附着在 IgG 抗体的重链上。由于修饰只发生在重链的 Fc 部分，因此标记的位置和DOL非常一致，抗原结合结构域保持不变。

图 8. SKBR3 球状体用 pHrodo 偶联抗癌药物（带有 MMAE的曲妥珠单抗）和 CellEvent Caspase 3/7Green（货号C10423）标记。

参考文献

Fu, Z., Li, S., Han, S. et al. Antibody drug conjugate: the “biological missile” for targeted cancer therapy. Sig Transduct Target Ther 7, 93 (2022). https://doi.org/10.1038/s41392-022-00947-7