解谜细胞凋亡-Caspase的神秘力量

细胞凋亡概览

细胞凋亡是一种程序性细胞死亡过程，通过严格调控的细胞内信号传导机制执行。该过程对于维持组织稳态和正常发育至关重要。异常的细胞凋亡机制可能导致多种疾病，如细胞凋亡过度会引起神经退行性疾病，而细胞凋亡不足则与癌症的发生和发展密切相关。在凋亡过程中，细胞会经历一系列标志性事件，从最初的信号接收到最终的细胞解体，每一步都至关重要。理解这些过程不仅有助于揭示疾病机制，还能为新的治疗方法提供思路。

图1. 细胞凋亡进程图^[1]

细胞凋亡诱导途径

细胞凋亡的诱导途径主要包括外源性（Extrinsic）和内源性（Intrinsic）两种。

外源性途径（死亡受体途径）由细胞外部信号诱导，通过死亡受体介导。关键分子包括Fas受体和肿瘤坏死因子受体（TNFR）。当配体（如FasL或TNF-α）与死亡受体结合时，形成死亡诱导信号复合物（DISC），DISC激活Caspase-8，随后激活下游效应Caspase（如Caspase-3），引发细胞凋亡。

内源性途径（线粒体途径）由细胞内部信号（如DNA损伤、氧化应激）诱导，主要通过线粒体介导。关键分子包括Bcl-2家族蛋白质（如Bax、Bak）。促凋亡信号导致Bax/Bak在线粒体膜上聚集，形成孔道，释放细胞色素c。细胞色素c与Apaf-1和Caspase-9形成凋亡小体，激活Caspase-9，并进一步激活下游效应Caspase（效应型半胱天冬酶），执行细胞凋亡。

图2. 内源性途径和外源性途径细胞凋亡^[2]

Caspase检测方法

但无论外源或是内源性途径细胞凋亡，二者均通过激活效应Caspase启动细胞凋亡过程，效应Caspase是参与细胞凋亡过程的关键酶类，主要包括Caspase 3/7，因此，检测Caspase 3/7的活性对确认细胞是否发生凋亡、药物筛选和疾病研究非常重要。

常用检测方法根据实验样本的不同，可以分为均质法、FLICA（Fluorochrome-Labeled Inhibitors of Caspases）、荧光底物法、基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）的检测方法以及抗体检测法，这些方法帮助研究细胞凋亡的机制和过程。

CellEvent Caspase 3/7检测方法

CellEvent Caspase 3/7检测方法基于荧光底物法，底物中包含DEVD肽序列，当酶被激活时，该肽序列被切割，释放出强荧光信号。通过检测荧光强度的变化，可以评估Caspase 3/7的活性。与传统Caspase检测方法相比，这种检测方法对细胞的凋亡过程没有抑制作用，无需清洗，有助于实时监测细胞凋亡。它兼容活细胞成像和流式细胞术检测，操作简单，适用于多种实验需求。

图3. CellEvent Caspase3/7检测原理及Workflow

数据实例^[3]

为了研究星形孢菌素对凋亡的诱导作用，我们对HeLa细胞进行了长时间的荧光监测。我们先后用50 nM的TMRM染料和5 µM的CellEvent™ Caspase-3/7试剂对HeLa细胞进行染色。随后，用0.5 µM的星形孢菌素处理细胞，并持续采集7小时的图像。在这7小时的过程中，可以明显观察到星形孢菌素引起的线粒体膜电位丧失和caspase 3/7的激活，这分别通过TMRM信号（红色）的减少和Caspase 3/7信号（绿色）的增加得以显示（见图4）。此外，结合使用CellEvent™ Caspase-3/7和死细胞核酸染料PI，还可以通过流式细胞术检测凋亡细胞的比例（见图5）。

图4. 星形孢菌素诱导线粒体膜电位（红）下降和Caspase 3/7（绿）激活（10x，5 min/freq.）

图5. 不同浓度（0 µM 左，0.11 µM 右）星形孢菌素诱导细胞凋亡流式图

FAQs

Q CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent可以用于固定样本吗？

A 不可以，该试剂适用于活细胞染色，染色后可以用甲醛固定，不能直接染固定样本。

Q CellEvent Caspase-3/7 Green Detection Reagent染色后还能做免疫荧光实验吗？

A 可以，推荐先进行细胞表面染色和本产品的染色，固定后再进行其他细胞内的染色。

参考资料与文献：

1. Invitrogen 细胞功能分析产品选择指南

2. Yuan, J., & Ofengeim, D. (2024). A guide to cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 25(5), 379-395.

3. “凋亡使者-Caspase在凋亡分析中的应用” 赛默飞COT课程