内毒素基础知识：细菌内毒素/LAL检测指南

在本指南中，我们将帮助您了解不同的LAL检测选项，并提供避免细菌内毒素检测流程中常见挑战的建议。

什么是内毒素？

内毒素，或称脂多糖（LPS），是包裹并保护革兰氏阴性菌（如大肠杆菌，世界上研究最广泛的原核生物模型）结构性糖脂。.它们由一个核心寡糖链、O特异性多糖侧链（O抗原）以及有毒的脂质成分——脂质A组成。

革兰氏阴性菌在其整个生命周期中都会释放内毒素，尤其是在溶解性死亡过程中，会一次性释放大量内毒素。

内毒素对动物免疫系统具有强烈的激活作用。大量释放事件可引发休克、发热、炎症和败血症。内毒素也是医疗器械中最常见的致热原，监管机构对允许的内毒素含量设有标准。内毒素检测只是食品和医疗领域所需多种致热原测试中的一种。

为什么细菌内毒素检测（BET）很重要？

由于其医学意义重大体内（in vivo）以及干扰许多常见实验效率的能力体外（in vitro）在生命科学领域，像细胞培养和转染这样的研究过程中，内毒素监测是必不可少的。

以下几种情境中，了解内毒素水平至关重要：

• 在制造治疗性蛋白或细胞与基因疗法时进行生物样本处理，以防止后续污染。
• 在为活体模型开发液体纳米颗粒（LNP）或腺相关病毒（AAV）mRNA递送载体时。
• 在生物制药生产过程中，为遵守内毒素限值法规并确保患者安全和产品质量。
• 在纯化质粒并转染对内毒素敏感的细胞系时，以保持细胞健康和转染效率。
• 在验证饮用水可饮用性及商业食品产品安全性时。

我应该使用哪种类型的细菌内毒素检测（BET）？

如今，研究人员有多种细菌内毒素检测（BET）方法可供选择，每种方法在易用性、灵敏度、成本和法规考量方面都有各自的优缺点。

鲎试剂（LAL）检测法

在20世纪50年代初，Frederick Bang发现马蹄蟹的血细胞（变形细胞）在低浓度内毒素存在时会凝结。基于这一观察建立的凝胶凝块法是一种经济、特异且灵敏的检测内毒素方法。变形细胞裂解液的使用已成为制药和食品行业以及生命科学和医学研究领域检测内毒素的行业标准。

该Limulus变形细胞裂解液（LAL）内毒素检测法，是目前用于检测内毒素最常见的分析方法。LAL是从大西洋马蹄蟹Limulus polyphemus的血细胞中提取而来。一些检测配方可能会使用类似的裂解液（TAL），其来源于亚洲Tachypleus属的蟹类。变形细胞裂解液可用于简单的定性凝胶凝块测试，通过快速判断阳性（有凝块）或阴性（无凝块）来检测内毒素是否存在。LAL和TAL测试还可以通过显色法（基于颜色变化）或浊度法（基于浊度变化）提供定量信息。美国药典（USP）已经制定了LAL内毒素检测统一标准。

Qubit™ 和 Quant-iT™ 内毒素检测试剂盒

Qubit™ 和 Quant-iT™ 内毒素检测试剂盒是基于变形细胞溶解物的检测方法的一种子集，利用荧光技术提供便捷的操作流程和灵敏的动态范围。终点检测可根据样品输入体积，检测0.01 EU/mL至10.0 EU/mL。这满足了许多法规对内毒素限值的要求，体内（in vivo）研究和产品的限值最低可达0.1 EU/mL。Qubit 和 Quant-iT 检测方法可用于蛋白质、抗体和核酸类型样品。当与 Qubit Flex 荧光仪配合使用时，计算会自动进行，并且引导式操作流程有助于减少错误。Qubit 和 Quant-iT 内毒素检测方法共同提供与其他 BET 方法相当的结果，并可通过验证符合药典标准。

重组试剂盒检测法

重组检测方法通过使用重组蛋白替代 LAL，避免了动物源成分的使用。虽然该过程通常与 LAL 检测流程类似，但某些重组操作流程可能需要较长孵育时间或在内毒素检测方面表现出较低的动态范围。此外，重组检测方法作为受监管流程中的替代方案，通常需要额外验证。

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在进行内毒素/LAL检测时，我应考虑哪些挑战和建议？

污染控制方案

在实验室里，很少有事情像交叉污染那样令人沮丧，难怪许多人都在与不受欢迎的内毒素作斗争——LPS分子的结构本身就设置了障碍，其疏水性的脂质A锚点很容易吸附到常见实验器材的塑料（偶尔也包括玻璃）表面。同样，这些两性LPS分子具有极高的耐热性，远远超出标准实验室灭菌工艺的极限。

不过，你仍然可以控制一些因素来帮助减少交叉污染，包括：

• 使用无内毒素的LAL试剂、玻璃器皿以及塑料器皿，要记住许多标注为“无菌”的产品可能并不无内毒素
• 检查你的操作流程以尽量减少接触点，并经常更换手套
• 关注你所用耗材的检测限，以及它们是否满足你的检测范围需求，因为有些耗材无法在较低范围进行检测

控制标准与校准

标准品提供已知浓度的内毒素，用于准确校准和测量样品值。以下是一些建议：

• 内毒素标准品：您应使用经认证的标准品来生成标准曲线——USP指南建议使用三个标准品和一个空白对照，并进行重复实验。该建议覆盖100倍动态范围，每增加10倍范围应额外添加一个标准品。
• 加标回收测试：进行加标回收测试，以确保检测方法能够准确检测您的特定样品基质中的内毒素。USP85建议回收率在50-200%之间，但更严格的实验室可能要求回收率在75-150%之间。
• 适当稀释：适当稀释样品以避免抑制或增强检测反应。在方法开发过程中验证稀释因子。剧烈涡旋冻干内毒素标准品，因为内毒素容易附着在表面上。而LAL是一种酶，不应剧烈混合。
• 放行标准：如果您的实验室有放行标准指标，建议在您的标准曲线中包含一个此浓度的样品。这将确保您能够最大程度地确认未知样品是否高于或低于该阈值。

数据处理

药典机构要求进行初始线性回归，以确保标准品生成的曲线相关系数 r ≥ 0.98。之后，用户可以根据自己的标准调整曲线拟合方式以获得最佳拟合。通常情况下，经过背景校正、对数转换的非线性拟合能够为动态范围大于20倍的终点型LAL检测提供准确的拟合结果。

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培训

与任何检测一样，结果的好坏取决于移液技术。由于检测往往对时间敏感，使用正位移重复移液器可以减少耗时和错误。检测流程通常包含多个步骤，请针对所用的具体检测进行培训——污染和误差可能来自多个环节。

我可以在哪里了解更多关于新兴的内毒素/LAL检测方法的信息？

无论您是刚开始进行内毒素分析，还是准备深入高通量应用及更多领域，我们都能为您提供支持。

• 技术：Qubit荧光定量技术
• 技术：Quant-iT 检测
• 概述：内毒素定量、去除与检测
• 概述：内毒素检测方法
• 海报：脂质纳米颗粒（LNP）和腺相关病毒（AAV）基因递送系统的内毒素污染检测评估
• 海报：高通量应用中可靠核酸表征指南
• 海报：Qubit 和 Quant-iT 内毒素检测分析方法作为细菌内毒素测试替代方法的验证研究
• 海报：基于荧光的细菌内毒素检测——高灵敏度检测，流程灵活简化
• 海报：对一种新型基于荧光的高灵敏度细菌内毒素检测方法的评估

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