流式可固定活性染料选择与使用指南

为什么鉴定细胞死活？

样品中的死细胞会由于自发荧光以及非特异性的抗体或者染料结合，导致假阳性并增加背景信号，因此从流式实验数据中移除死细胞是确保结果精确的关键步骤。我们以数据说话，请看图片1中的例子，图中数据借助细胞死活染料排除了死细胞的信号干扰后，分析得到的CD8+或者CD19+细胞比例更准确了。因此，推荐大家进行流式实验时，尽量搭配上细胞死活染料。

图 1. 细胞死活染料排除死细胞干扰。 通过光散射的门控圈出目标淋巴细胞，分析后的CD8+或者CD19+细胞比例明显偏高（上图）；相同样品借助死活染料，排除了死细胞的信号干扰后，分析后的CD8+或者CD19+细胞比例更准确了（下图）。

如何选择合适的死活染料？

传统的流式细胞死活染料为细胞膜非通透性的核酸染料，例如PI、7-AAD、DAPI。这类核酸染料能穿过死细胞的细胞膜，结合核酸后发出荧光，而无法穿过活细胞的细胞膜。

但是，如果实验涉及到胞内染色，细胞需要固定破膜，您可能会遇到图2上图这种情况，核酸染料会将所有的细胞都染上颜色，难以分辨死活信号。此时您应该选择可以固定的细胞死活染料，即Fixable viability dye。

图 2. 固定后 LIVE/DEAD™ Fixable dye信号可保留。分别用PI或LIVE/DEAD™ Fixable Stain标记细胞，PI标记的细胞固定后难以分辨死活信号（上图），LIVE/DEAD™ Fixable dye在固定后维持了死细胞和活细胞的区别（下图）。

Fixable viability dye（LIVE/DEAD™ Fixable dye）是一种细胞膜非通透性的胺反应染料，这些染料只能穿过细胞膜受损的细胞，与细胞表面或者细胞内的游离胺基形成共价结合（见图3）。且由于共价偶联比较稳定，因此对细胞染色后可以兼容醛类固定和破膜处理，染色结果不受影响（见图2下图）。

图3. LIVE/DEAD 可固定死细胞染色原理。 非细胞通透的胺反应染料仅能结合到活细胞的表面，产生非常微弱的荧光。这些染料可穿透死细胞的细胞膜并与内部的蛋白发生结合，从而产生极强的荧光。

下表是两种染料的选择指南

死活染料类型	核酸类死活染料
染色原理	细胞膜非通透性的核酸染料，可进入细胞膜受损的细胞并与dsDNA/RNA发生结合，但不能穿透完整的细胞膜
染色顺序	表面染色结束后，流式检测前染色
是否可染色后固定	不可以
荧光颜色的选择	颜色选择少，多色流式配色受限
常见染料	PI、7-AAD、DAPI、Invitrogen ™SYTOX系列染料

死活染料类型	Fixable viability dye
染色原理	细胞膜非通透性的胺反应染料，可进入细胞膜受损的细胞，与细胞表面和细胞内的蛋白结合，无法进入细胞膜完整的细胞仅与细胞表明的蛋白结合
染色顺序	在表明染色开始前
是否可染色后固定	可以
荧光颜色的选择	颜色范围广泛，涵盖UV、405、488、532/561及633nm激光，灵活满足多色流式配色需求
常见染料	Invitrogen ™ LIVE/DEAD可固定死细胞染色剂、eBioscience™ fixable viability dye

常见问题

使用Fixable viability dye时，染色液有什么要求？

当使用可固定的细胞活性染料时，Tris缓冲液和含有叠氮化钠或外来蛋白质的溶液不能作为细胞染色缓冲液，因为溶液中含有这些物质可能导致死细胞群染色强度的显著降低和/或活细胞群背景染色的增加。

流式实验中，利用LIVE/DEAD Fixable dead cell stain或者是Fixable Viability Dye 胺基反应染料鉴定死活细胞，需如何制备补偿单染管？

补偿样本中需要同时检测到阳性信号和阴性信号，我们提供两种方案：
准备活细胞与死细胞的混合样本：将一份活细胞样本平均分成两份，一份不做处理，一份制备成死细胞，制备完成后将两份样本重新混合，再进行染色。制备死细胞的方法请参考如下描述：可以通过60°C放置20分钟热灭活细胞。或将细胞放入70%乙醇固定，乙醇固定的细胞可以保存在-20°C，使用前再取出。
利用ArC™ 胺反应补偿珠试剂盒（货号A10346），该产品可与具有胺反应性的LIVE/DEAD Fixable dead cell stain或者是Fixable Viability Dye可固定死细胞染料结合，以用于流式补偿调节，而无需自己制备补偿样本。

Fixable Viability Dye流式染色结果如何解读？

相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，但是可以通过信号的强弱来区分活细胞和死细胞。其中活细胞的细胞膜完整，仅细胞表面蛋白胺基结合了染料，呈现较弱的荧光信号；而死细胞的细胞膜通透性改变，染料能够进入死细胞，与细胞内和细胞表面蛋白上的胺基结合，因此死细胞呈现更强的荧光信号。（见图4）

图4. Fixable Viability Dye流式染色结果解读。将未染色细胞和Fixable Viability Dye染色细胞流式分析结果合并分析。相对于未染色的细胞，Fixable Viability Dye染色的细胞整体都会检测到荧光信号，其中死细胞呈现比较强的荧光信号，而活细胞呈现的信号较弱。