一文看懂所有流式对照

Q Dr.赛，我想知道在流式实验中都要做哪些对照组？

A 常用流式对照有空白对照、单染阳性对照、荧光减一对照、同型对照，还有生物学对照。

Q 啊，这么多？！这些对照都是必需的吗？要怎么制备这些对照样本呢？

A 来，我给大家总结了一下流式实验需要设置的对照们，快快收藏吧！

常用的流式对照有空白对照、单染阳性对照、荧光减一(FMO)对照、同型对照、生物学对照等。

空白对照：区分细胞自发荧光

空白对照即未染色的样本，可以帮助区分细胞本底的或者因药物等处理导致的荧光，还可以辅助调节电压（图1）。

图1*. 未染色的小鼠脾脏细胞作为空白对照

单染阳性对照（补偿对照）：调节补偿

单染阳性对照即只染多色方案中其中一个荧光基团的对照管，可以用于调节补偿和电压。实验方案中有几个不同的荧光基团，就需要设置几个单染对照组。单染阳性对照应具有明显的阴阳分群，并且需要有足够数量的阳性峰细胞。

图2*. 单染阳性对照用于调节补偿

荧光减一(FMO)对照：辅助圈门

荧光减一对照即使用扣除了一个荧光基团的所有染色组合来标记样本的对照，帮助更准确地设置圈门位置。FMO对照对于低水平表达或者连续表达的抗原尤为重要。

图3* 荧光减一对照（FMO）辅助设置圈门位置

同型对照：排除抗体非特异性结合

同型对照即使用与实验抗体相同种属来源、相同亚型以及相同荧光标记但对靶标无特异型性结合的抗体对样本进行染色，用于消除抗体非特异性结合而产生的背景荧光 (图4)。

图4*. 同型对照抗体排除抗体非特异性结合产生的背景荧光  使用同型对照抗体（Rat IgG2a PE）或者Foxp3 PE抗体对小鼠脾脏单细胞悬液进行染色并进行流式分析。

生物学对照：解决科学问题

生物学对照即我们常说的实验对照，主要用于比较实验样本与特定条件下的样本之间的差别。比如，在探究某个化合物诱导细胞凋亡的实验中，还需要设置未经化合物处理或者使用vehicle处理的细胞作为实验对照（图5）。

图5*. 星形孢菌素诱导的细胞凋亡。未经处理的（A）和使用 1 μM 星形孢菌素处理4小时后（B）的 Jurkat 细胞，使用Annexin V Alexa fluor 488和PI染色并进行流式分析。经星形孢菌素处理的细胞（B）中，凋亡细胞比例（72.061%）明显高于对照细胞（A）中凋亡的基础水平(9.337%)。

写在最后：如何设计对照组？

在最后，我们以CD4-FITC、CD25-PE和Foxp3-APC的配色方案，来向大家展示一下在流式实验中需要准备哪些对照组的样本。假如我们需要检测化合物A对于小鼠脾脏Treg细胞比例的影响，我们需要准备以下9组样本：

Question & Answer

Q 如果样本中的阳性细胞数量比较少，该如何获得单染阳性对照管？

A 对于表达丰度比较低、阳性率比较低的靶标，或者是细胞数量比较少的样本，建议使用补偿微球来代替细胞制备单染阳性对照。

Q 荧光减一对照是必须要做的吗？在哪些情况下需要准备FMO对照？

A 并非所有的抗体都需要做FMO对照，对于CD3、CD4、CD8这种阴阳分群比较明显的靶标，可以不做FMO对照，但是对于低水平表达或者连续表达的抗原，建议设置FMO对照。

Q 生物学对照一般需要设置几个？

A 生物学对照的数量需要根据实验目的和实验条件来设计，细胞是否经过改造、是否需要刺激、是否经药物处理、是否需要阳性对照和阴性对照等等都需要纳入考虑的范围，在设置生物学对照时，应遵守控制单一变量的原则。

*以上数据均出自赛默飞流式细胞术精品培训班，所用流式细胞仪为Attune™ NxT流式细胞仪。