Gibson 组装 101：您需要了解的专业克隆技巧赛默飞中国博客

Gibson Assembly 101: Expert Cloning Tips You Need to Know

Gibson Assembly®（吉布森组装）或称吉布森克隆，是一种强大的分子克隆技术，是传统限制性内切酶方法的一种流行替代方案。

通过单管恒温反应，Gibson Assembly能够无缝连接DNA片段。它特别适用于从多个片段构建大型或复杂的结构，并且可能比其他克隆方法更快。

无论您是一位经验丰富的研究人员，还是刚接触Gibson Assembly实验方案的新手，本指南都汇集了我们分子生物学领域专家研发科学家的经验与心得。

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什么是Gibson组装？

Gibson组装是一种强大的DNA组装方法，依赖于三种酶：外切酶、DNA聚合酶和DNA连接酶。

该过程包括四个主要阶段：

外切酶处理：该酶从DNA片段的5′端开始切割，形成单链突出末端。
退火：DNA片段的互补区域相互退火结合。
DNA聚合酶延伸：DNA聚合酶填补缺口。
连接DNA连接酶可封闭DNA主链中的切口，从而形成连续的DNA分子。

你可以将每个DNA片段想象成一块墙纸或礼品包装纸的碎片；若想将两块碎片连接在一起而看不到接缝，可以寻找两个碎片剪切边缘处图案完全重叠的区域，然后将它们粘合在一起。

在这个类比中，每个DNA片段末端的单链突出部分就像图案的边缘——由外切酶切割形成，而退火过程则类似于寻找视觉上图案重叠的过程。聚合酶和连接反应将片段固定在一起，不会留下任何可见的痕迹或疤痕。

Gibson Assembly DNA assembly workflow — *DNA组装流程*

何时以及为何使用Gibson Assembly进行分子克隆

吉布森（Gibson）组装技术相比传统的限制性内切酶克隆方法具有一些优势，包括：

能够同时连接多个DNA片段（最多可达6个），无论其序列如何，且无需特定的限制性酶切位点
片段之间可以实现精确且无缝的连接，不会产生疤痕
相比限制性酶切克隆方法，步骤更少、耗时更短——通常在一小时之内即可完成

吉布森克隆技术具有许多实际应用，可用于无缝质粒构建、合成基因和基因组组装、CRISPR载体构建、定点突变、模块化DNA元件组装，以及用于基因治疗和研究的病毒载体开发。

Gibson Assembly实验方案

该 Gibson 组装克隆方法是一种单步等温过程，通常所需的动手操作时间不到一小时，具体时间取决于所涉及的DNA片段数量。

该实验方案有四个关键步骤。

1. 获取DNA片段

Gibson组装的成功与否在很大程度上取决于DNA片段及其重叠区域的设计。

请仔细设计重叠序列。

重叠区域长度应控制在20-40个碱基对，并确保其具有较高的GC含量以促进稳定的退火结合。可以使用如下软件工具： SnapGene™ 可用于精确设计这些重叠区域。

优化PCR条件

为了确保高质量的PCR产物，请针对每个DNA片段优化PCR条件。使用高保真DNA聚合酶，例如Platinum™ SuperFi II PCR预混液，以减少错误并确保产生干净、特异的片段。纯化PCR产物以获得干净的DNA片段，并在进行下一步之前通过凝胶电泳验证PCR产物的完整性

线性化所选载体

选择适合您组装需求的载体，并通过限制性内切酶或PCR将其线性化。线性化至关重要，因为它为片段的退火和连接提供了必要的末端。当使用环状质粒DNA作为模板时，请使用 DpnI 以减少转化后的模板背景。

2. 执行Gibson反应

要实现成功的Gibson组装，必须仔细优化反应条件。可以使用诸如 GeneArt™ Gibson Assembly™ HiFi Master Mix.

请小心地将您设计的DNA片段和线性化载体混合

确保准确计算并正确分配单管反应中每种组分的用量。关注这些细节有助于实现高效的DNA片段组装。

包含对照反应

在实验中始终包含阳性和阴性对照。阳性对照可确认组装反应条件的有效性，而阴性对照（缺少一个或多个DNA片段）有助于识别潜在污染或非特异性组装。

3. 转化感受态细胞

使用高效感受态细胞，例如 One Shot™ TOP10 Chemically Competent E. coli, 以最大化获得成功的转化子数量。适当的孵育时间和温度对于获得最佳结果至关重要。

将转化混合物涂布在合适的平板上

将转化后的细胞涂布在选择性LB琼脂平板上，以分离单个菌落。此步骤对于确保只有含有正确组装DNA构建体的细胞才能生长至关重要。

4. 筛选构建体的菌落

筛选多个菌落以验证您的DNA构建体是否正确组装。使用菌落PCR、限制性酶切或测序方法来确认组装好的DNA的存在及其准确性。一旦验证正确，分离并扩增正确的克隆以用于后续实验。

Gibson组装的故障排除与常见问题

以下是我们研发专家分享的他们从研究人员那里听到的一些最常见的Gibson克隆问题的解答。

1. 如何加快组装过程？

研究人员可以通过使用未经纯化的PCR产物、缩短反应时间或使用快速转化方案来加快组装过程。

使用未经纯化的PCR产物

为了加快组装过程，可以考虑直接使用PCR产物（无需纯化）进行Gibson组装。只需收集每种片段最多4 µL，然后继续进行组装。这种简化的方法可以节省时间，同时仍能获得有效的结果。

缩短反应时间

为了节省时间，您可以缩短组装时间。该协议时间针对不同的组装进行了优化，确保产量不会受到显著影响。这种简化的方法不仅节省时间，还能保持有效的结果，使您的工作流程更加高效。

使用快速转化方案

对于希望加快转化过程的用户，可以考虑使用快速转化方案。这种方法包括缩短孵育时间，并使用专为快速转化而优化的试剂。只需将感受态细胞与DNA混合，然后直接涂布到选择性LB琼脂平板上，无需热激或恢复步骤。

该方法在使用氨苄青霉素选择平板进行转化时尤其有效。快速方案可显著减少所需时间，同时转化效率仅有微小变化。

2. Golden Gate组装与Gibson组装：有什么区别，我应该用哪一个进行克隆？

在DNA克隆方面，选择合适的组装方法会显著影响实验的成功。Golden Gate组装和Gibson组装是两种常用技术，各自具有独特优势。

Golden Gate组装利用IIS型限制性内切酶构建无缝DNA片段，因此在重复性克隆任务中效率很高。而Gibson组装则通过混合多种酶，在单一恒温反应中连接多个DNA片段，适用于组装更大、更复杂的结构。

如果你的项目需要高精度的模块化克隆，Golden Gate 方法可能是更优的选择。然而，如果需要同时组装大片段DNA或多个插入片段，Gibson Assembly 可能更为合适。了解克隆项目的具体需求将有助于你决定使用哪种方法。

3. 如何设计Gibson组装的引物？

为Gibson组装设计引物时，需要创建在其末端具有重叠序列的引物，以便与待连接的DNA片段末端匹配。以下是关键步骤：

确定重叠区域：确定每个片段连接所需的20-40个碱基的重叠序列。
设计引物序列：确保每条引物的5′端包含重叠序列，而3′端则为与目标DNA互补的区域。
检查熔解温度：确认所设计引物的熔解温度（Tm）相容，理想情况下彼此之间的差异应在2-3°C以内。选择熔解温度（Tm）高于50°C的同源重叠区域可以提高组装效率。
避免二级结构：使用软件工具确保您的引物不会形成发夹结构或二聚体。遵循这些步骤将帮助您设计出高效的引物，以确保Gibson组装反应的成功。

4. DNA片段进行Gibson组装时合适的重叠长度是多少？

Gibson组装的合适重叠长度通常在20到40个碱基对之间。这一长度足以确保片段之间能够特异性且稳定地退火结合。

短于20 bp的重叠可能无法提供足够的特异性和稳定性，从而导致组装效率低下；而长于40 bp的重叠可能不会显著提高效率，反而会使引物设计更加复杂。因此，在Gibson组装过程中，保持在此范围内设计重叠序列对于实验的成功至关重要。

Gibson等温组装：一种便捷快速的替代克隆方法

Gibson组装是一种多功能且高效的DNA组装方法，通过精心规划和注重细节，您可以掌握该技术。通过遵循上述关键技巧，您可以优化实验方案，在克隆实验中获得可靠且高质量的结果。

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