TaqMan检测方法的工作原理

聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学中最强大的技术之一。利用PCR，可以将DNA或互补DNA（cDNA）模板中的特定序列进行成千上万甚至百万倍的复制或“扩增”。在传统的终点PCR中，扩增序列的检测和定量是在最后一个PCR循环结束后进行的，并涉及凝胶电泳和图像分析等后续分析。由于反应是在完成后才被检测，终点PCR的数据是半定量的，通常用于判断扩增是否成功。在实时或定量PCR中，通常简称为实时荧光定量PCR或qPCR，每个循环都会测量PCR产物。通过在反应的指数扩增阶段监测反应过程，用户可以非常精确地确定目标初始数量。有多种反应化学方法可以实现这一过程，但Applied Biosystems™ TaqMan™ 检测试剂盒长期以来一直是使qPCR变得简单、精确、特异且高效的金标准。

那么它们是如何工作的呢？

引物、探针与荧光信号

TaqMan检测试剂盒的标志性特点是探针。这种与被测DNA模板匹配的小片段DNA上连接有两种特殊分子：一种是荧光报告染料（R），另一种是猝灭剂（Q）。当这两种分子都连接在探针上时，染料的荧光会被猝灭剂抑制。这些探针在模板DNA变性为单链后但尚未开始复制前结合到模板上，从而确保所有模板复制过程都能与探针发生作用。

TaqMan探针的一大独特之处是在其3’端添加了次沟结合体（MGB）基团，这一修饰能够提高探针的熔解温度（Tm），并稳定探针-靶标杂交体。这意味着TaqMan MGB探针可以比传统探针显著更短，从而提供更好的序列识别能力，并具备更大的灵活性以适配更多靶标。

Primers taq Taq polymerase Thermus aquaticus, Taq

引物是能够结合到模板链两端（5’端和3’端）的短DNA序列。这些序列经过精心设计，以尽可能特异地识别模板，并作为反应的锚点，使得Taq聚合酶能够开始复制DNA模板。如果没有优良的引物，PCR反应——无论是定量还是其他类型——都可能无法扩增任何DNA，或者由于非特异性扩增而干扰分析。这在另一种常见的qPCR化学方法SYBR Green染料中尤为值得关注，因为该染料能与任何双链DNA结合，因此可能导致非目标片段的扩增。

Taq聚合酶是一种特殊版本的DNA聚合酶，来源于嗜热菌（Thermus aquaticus），它比大多数其他生物来源的DNA聚合酶能耐受更高温度。这个Taq聚合酶还有一个额外的优势：外切酶活性。当聚合酶遇到已经结合在其正在复制的模板链上的探针时，它会消化该探针，并继续复制剩余的链。在这个过程中，聚合酶将荧光染料和猝灭剂彼此分离，解除猝灭剂介导的抑制，从而产生荧光信号，被qPCR仪器检测到。

由于这种信号与反应中模板DNA的数量完全成正比，因此使得qPCR具有定量能力。

观看视频：TaqMan实时PCR分析如何工作——Taq Talk第4集

TaqMan分析相比许多其他qPCR化学方法还有一个额外优势，即它们兼容多种不同的荧光探针。这意味着可以在同一次qPCR反应中同时检测多个DNA模板，因为它们的读数不会重叠。这被称为多重检测（multiplexing）而这种能力是SYBR Green反应所不具备的，在SYBR Green反应中，单一荧光染料会对反应中的任何双链DNA（无论是否特异）激活。

观看视频：单重与多重qPCR实验注意事项——Taq Talk第23集

简化工作流程

有进取心的研究人员可以利用我们的定制检测设计流程，根据特定应用量身定制检测方法，这些应用可能过于稀有或特殊，无法使用现成解决方案。但对于研究常见基因靶点的科学家来说，预设计的TaqMan检测大大简化了qPCR工作流程。使用预设计检测，无需额外设计、优化、熔解曲线分析或其他验证——只需添加样品和主混合液即可。此外，每个预设计的TaqMan检测都提供性能保证*，让您的结果更具信心。Thermo Fisher 提供超过2100万种预设计TaqMan检测，涵盖大量基因和物种，因此极有可能已有适用于您的案例的产品。强大的生物信息学和设计流程确保预设计TaqMan检测具有一流的特异性、灵敏度和可重复性，每次都能获得出色结果。通过Assay Search Wizard轻松找到预设计的TaqMan检测如需了解更多关于TaqMan检测及其在实验室中的作用，请参阅此关于其工作原理的简要介绍,深入解析，或对其设计理论与实践的探讨.

了解更多信息

实时PCR数字手册2.0：探索实时PCR最佳实践、基本原理及故障排除技巧。

请观看完整的 Applied Biosystems Taq Talk 视频系列作为实时 PCR 的资深专家，我们在该视频系列中解答您最常见的实时 PCR 问题和挑战。

*适用条款和条件。要查看保证的详细信息，请访问thermofisher.com/taqmanguarantee.

仅供科研使用。不得用于诊断程序。