活细胞ROS全景观测–荧光探针标记策略

活性氧族（reactive oxygen species，ROS）是氧的部分还原代谢物，它包括超氧阴离子自由基（O₂•⁻）和其他一些氧自由基，以及一些非自由基型的氧衍生物，例如：过氧化氢（H₂O₂）、次氯酸（HOCl）和过氧亚硝酸盐/过氧亚硝酸（ONOO⁻ / ONOOH）等。这类物质具有强氧化能力。细胞内活性氧(ROS)的主要来源为线粒体、过氧化物酶体、内质网(ER)应激、NADPH氧化酶等，此外也有一些外源性刺激如辐射、化学物质等【图1】。在生理浓度下，它们可在血管细胞的信号转导、免疫细胞的呼吸爆发等过程中发挥重要作用。细胞利用抗氧化酶（例如超氧化物歧化酶，SOD;过氧化氢酶，catalase；谷胱甘肽过氧化物酶等）等使ROS维持在生理水平，当这种系统受损，可能导致氧化应激状态。ROS参与到多种疾病如癌症、心血管疾病、神经退行性疾病的发生发展中。

图1 ROS 的胞内外来源

那么有哪些荧光探针可以用于活细胞氧化应激水平的检测呢？接下来就与Dr.赛一起看看吧！

细胞氧化应激水平检测

为了研究细胞整体的氧化应激水平，需要采用广义的ROS荧光探针。这类探针被多种胞内ROS氧化后发出荧光，从而指示其水平。H2-DCFDA (货号D399)，CM-H2-DCFDA(货号C6827)和羧基-H2-DCFDA (货号C400) 等传统绿色荧光探针用于广义ROS的测定，与 H2-DCFDA 相比，羧基-H2-DCFDA和 CM-H2-DCFDA在细胞内能较好的保留。上述几种探针染色时无法兼容含血清的完全培养基，CellROX™ Green的出现完美的解决了这个痛点。考虑到有些研究场景下细胞会内源性表达GFP, 因此我们在CellROX™ Green的基础上还开发了CellROX™ Orange 和CellROX™ Deep Red 两款染料（Table 1），其中CellROX™ Deep Red 具有优越的光稳定性【图 2】。CellROX™ Green和Deep Red 兼容多聚甲醛固定，CellROX™ Green兼容下游Triton X-100的透化过程【表1】。CellROX™ 系列染料已在多色流式染色中得到应用【图3】。

表1

几种ROS检测试剂的比较	CellRoX® Deep Red Reagent	CelROX® Orange Reagent	CelIROX® Green Reagent	H2-DCFDA*
是否需染色活细胞	是	是	是	是
是否可以在完全培养基中标记	是	是	是	否
是否兼容多聚甲醛固定	是	否	是	否
是否兼容Triton X-100 透化	否	否	是	否

图2 CellROX® Deep Red 试剂的光稳定性分析

将人骨肉瘤 (U2OS) 细胞用 100 μg/ml 甲萘醌处理 1 小时，然后在 37°C 下与 5 μM CellROX Deep Red 试剂（货号 C10422）在完全生长培养基中孵育 30 分钟，或与 5 μM H2DCFDA（溶于 HBSS）一起孵育。细胞在成像前用 HBSS洗涤 3 次。样品在蔡司 Axiovert 倒置显微镜下连续照射 14 秒，CellROX Deep Red 试剂和 H2DCFDA 的曝光时间分别为 500 毫秒和 150 毫秒。使用 SlideBook™ 5 软件定量荧光信号强度，以归一化强度值表示，并绘制其与光照时间的关系图。

图3 未受刺激和 TBHP 刺激的经典单核细胞中的CellROX green染色分析。C图中红色线条代表TBHP刺激组，蓝色线条代表未刺激组。

线粒体ROS 检测

超氧阴离子检测

超氧化物阴离子是线粒体氧化磷酸化的副产物。超氧化物的生成，尤其是由于氧化磷酸化复合物 I（NADH-醌氧化还原酶）受到抑制而产生的超氧化物，是导致毒性和线粒体功能障碍的普遍原因。超氧化物歧化酶 (SOD) 通过将过量的超氧化物转化为活性较低的过氧化氢，发挥着关键作用。

MitoSOX™ 染料对线粒体超氧阴离子有较高特异性，可以点击相关阅读“【热点直击】线粒体活性氧怎么检测？”进行了解。已有大量文献证实线粒体ROS与多种疾病进程有相关性，MitoSOX™ 染料不仅可以用于成像也可以用于流式。例如用Aβ1-42 处理小鼠 HT-22  hippocampal neuronal cells，可以在镜下观察到MitoSOX™ Green 荧光增强，同时伴随着线粒体膜电位的降低和死细胞增加【图4】。在由杜氏肌营养不良病人来源的iPSC诱导的心肌细胞中，利用MitoSOX™ Red的流式染色方法指示了病人来源的细胞中有更高的线粒体ROS水平【图 5】。

此外，Dihydroethidium (Hydroethidine) (Cat. No. D11347)二氢乙锭也可以用于超氧阴离子检测。

图4 与健康对照组相比，Aβ 处理的神经元的线粒体膜电位 (MtMP)、活性氧 (ROS) 生成和细胞活力。(A) 代表性荧光图像和 (B) 图表分别显示使用 Image-iT™ TMRM 染色的神经元（用于检测 MtMP）、使用 MitoSOX™ 染色的神经元（用于检测线粒体 ROS）和使用 PI/calcein 染色的神经元（用于检测细胞活力）。

图5 杜氏肌营养不良病人来源的iPSC分化的心肌细胞, 线粒体内的ROS 水平极高。用一些药物处理或者进行基因修正，会显著改善ROS 水平。

其他种类的ROS 检测

Nitric oxide检测的试剂 DAF-FM™ （货号D23841）和 DAF-FM™ Diacetate（货号D23844）;以及检测细胞内H₂O₂水平，基于杆状病毒感染系统的 Premo™ 细胞过氧化氢传感器（货号P36243）。脂质过氧化是活性族分子作用于脂类大分子的过程，Dr. 赛之前已经详细介绍过了，可点击相关阅读了解更多：【国自然热点】铁死亡研究核心利器

其他氧化应激相关检测试剂

ROS 含有多种类型，检测时需要在细胞活率、功能等多角度进行进行验证。例如检测胞内 谷胱甘肽（ (Glutathione, GSH）水平的 ThiolTracker™ Violet （货号 T10096 ），以及胞外水平的超氧化物歧化酶(货号EIASODC)、过氧化物酶（货号A22188）等酶含量的检测试剂盒。

氧化应激检测试剂推荐

检测指标	推荐产品名称	货号	规格	目录价	飞享价
广义ROS	CellROX Deep Red广义ROS检测试剂	C10422	5 x 50 uL	8,138	6,043
脂质过氧化	Image-iT 脂质过氧化检测试剂盒	C10445	500T	6,881	5,112
线粒体ROS	MitoSOX Green线粒体超氧化物指示剂	M36005	1 x 9 ug	1,951	1,448
谷胱甘肽	ThiolTracker Violet谷胱甘肤检测试剂	T10096	5×96孔	4,311	优惠价咨询赛默飞销售代表

FAQ

Q：我试着用活性氧（ROS）指示染料标记我的细胞，但没有观察到信号的明显差异。该如何解决呢？

A：首先确保您同时拥有一个阴性（未处理）和一个阳性（ROS诱导）样本进行比较。100 µM甲萘醌（Menadione）1小时或是50 µM奈法唑酮（Nefazodone）24小时可以作为很好的阳性对照。H₂O₂ 虽然不能很好地与CellROX染料兼容，但也可以用于阳性对照。其次，某些如H2DCFDA的染料需要酯酶切割，所以不能在血清（血清中包含的酯酶可过早切割染料）存在的情况下进行染色。如果您的阳性对照相对于阴性对照没有明显变化，尝试着增加染料浓度和标记时间。进行活细胞成像时尽可能得快。只有两种染料（CellROX Green和CellROX Deep Red）经甲醛固定处理后能保留在样品中。最后，确保您使用的滤光片和仪器设置与染料的激发和发射光谱相匹配。

Q：ROS检测试剂能不能用于石蜡、冰冻组织检测？

A：由于大部分活性氧族是属于一过性物质，可能产生后随机与生物大分子反应，从而无法保留。

Q：ROS检测试剂能不能用于活着的组织？

A：我们未验证过，但是有一些文献是有在胚胎组织、斑马鱼、线虫等模型中使用，具体应用还需再参考文献。

参考文献

1)Saniya Arfin, Niraj Kumar Jha, et al.(2021). Oxidative stress in cancer cell metabolism. Antioxidants, https://doi.org/10.3390/antiox10050642

2)Yin, H., Xu, L., Porter, N. A., et al. (2022). Guidelines for measuring reactive oxygen species and oxidative damage in cells and in vivo. Nature Metabolism, https://doi.org/10.1038/s42255-022-00591-z

3)Dickinson, B. C., Huynh, C., & Chang, C. J. (2010). A palette of fluorescent probes with varying emission colors for imaging hydrogen peroxide signaling in living cells. Journal of the American Chemical Society, https://doi.org/10.1021/ja1014103

4)Wang, L., Sievert, D., Clark, A. E., Lee, S., Federman, H., Tomishima, M. J., & Studer, L. (2021). A human three-dimensional neural-perivascular ‘assembloid’ promotes astrocytic development and enables modeling of SARS-CoV-2 neuropathology. Stem Cell Reports, https://doi.org/10.1016/j.stemcr.2021.11.005

5)Iuliia Golovynska1†, et al.(2025). Amyloid-induced mitochondrial network disruption in neurons monitored by STED super-resolution imaging. Frontiers in Cell and Developmental Biology, https://doi.org/10.3389/fcell.2025.1610204

6)Theodoros Kelesidis, Elizabeth Tran et al.  (2023). Elevated cellular oxidative stress in circulating immune cells in otherwise healthy young people who use electronic cigarettes in a cross‐sectional single‐center study: Implications for future cardiovascular risk. Journal of Hazardous Materials, https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2023.131189

7)Smith, J. P., Rodriguez, K. M., & Chen, L. (2024). Optimizing isolation and functional assays of classical monocytes from cryopreserved PBMCs. Cellular Immunology, https://doi.org/10.1016/j.cellimm.2024.104812