PrimeFlow流式RNA分析在抗体药研发上的应用

如何从免疫调节类药物开发视角来看混合淋巴细胞反应？

众所周知，针对免疫调节类药物，尤其是免疫检查点类抗体药物，如anti-PD-1，anti-CTLA4，anti-Lag3等，混合淋巴细胞反应（Mixed Lymphocyte Reaction, MLR）为该类药物必不可少的申报项。MLR是通过表征来源于异体的两群淋巴细胞混合共培养来检测DC细胞介导的T细胞活化所产生的细胞因子表达。

对于细胞因子的上清检测，有传统的ELISA方法，也有基于邻位连接测定（PLA™）技术的ProQuantum，以及基于 Luminex xMAP（多分析物谱分析）的多因子检测技术ProcartaPlex；同样有基于原位流式分析，同时在RNA水平及蛋白水平同时进行流式分析的PrimeFlow 流式RNA分析。

PrimeFlow 流式RNA分析采用了专利的FISH和bDNA信号放大技术，RNA检测可与细胞内和细胞表面抗体染色相结合，以提高对单细胞动力学的认识。工作流程包括下列几个步骤：抗体染色；固定和破膜，包括细胞内染色(如需要)；然后是与包含20–40个寡核苷酸对的靶点特异性探针组的靶向杂交。

图1. PrimeFlow流式RNA分析简明操作步骤

如何通过PrimeFlow进行MLR原位分析？

该研究通过协同采用PrimeFlow技术（核酸水平）及ELISA技术（蛋白水平）开展MLR实验来进行功能性抗体高通量筛选。

图2. 抗体药MLR实验基本流程

通过流式PrimeFlow流式RNA分析原位检测IFNγ mRNA 表达操作如下：

• Step1. 根据靶点信息进行探针设计及流式配色方案制定；
• Step2. 制备细胞样本并进行可固定死活染色及抗体表面染色；
• Step3. 分别进行细胞固定-破膜-固定步骤，如需要胞内蛋白染色，则在第二次固定之前完成；
• Step4. 加入目标特异性探针进行靶标杂交；
• Step5. 通过加入信号预放大探针，信号放大探针以及标记探针进行信号放大；
• Step6. 根据分析方案进行流式上机检测。

探针设计 | 请在赛默飞官网中查找

www.thermofisher.cn/PrimeFlow

图3. PrimeFlow RNA 探针设计步骤

实验中，为了确保实验体系可行性，阳性对照探针的选择也非常关键，不同种属、组织及细胞类型的内参基因推荐可以参考下表。

图4. 不同组织中内参基因表达情况

针对3种MLR分析方法对8个双特异性抗体（其中7个待测抗体，1个阳性对照抗体）选择96孔板模式，以阳性对照抗体设计预实验确认体系。

图5. T 细胞激活预实验设计及体系确认。左图为未刺激条件下产生的T细胞应答，右图为未刺激条件下产生的T细胞应答，RPL13A: Housekeeping gene。

预实验结果可以看到，未刺激组几乎没有检测到IFNγ在mRNA水平表达，但在刺激组可以明显看到T细胞活化后的SSC信号加强及IFNγ的mRNA 表达增加。

在预实验确认体系基础上，对包括对照抗体在内的8种抗体进行MLR功能筛选。

图6. PrimeFlow流式RNA分析进行抗体药MLR功能筛选实验。图中，MFI为流式胞内检测IFNγ mRNA水平的平均荧光值。Ab1-Ab7:待测双抗组；Ab8:阳性对照双抗；AbNc:阴性对照双抗；Blank：不加抗体组

经过统计学分析，可以看到其中Ab3,Ab5,Ab7表现出最高的IFNγ水平，即最强T细胞激活应答的3个抗体样本，Ab3甚至较阳性对照抗体更强。

为了进一步评价IFNγ在蛋白水平表达，同样采用以上3种方法在同样时间点，针对这8种双特异性抗体进行ELISA检测。

图7. Ab1-Ab7:待测双抗组；Ab8:阳性对照双抗；AbNc:阴性对照双抗

经过统计学分析，Ab2,Ab3,Ab5在3种MLR分析方法均表现出高于对照抗体药的IFNγ水平，结合mRNA表达看，在该时间点，Ab3,Ab5在蛋白表达和核酸表达均相对较高，其他像Ab7的核酸水平表达较高，Ab2的蛋白水平较高，初步估计与两者动力学差异相关。

小结

总的来说，基于分支DNA 的PrimeFlow 流式RNA分析对于抗体，特别是ICI靶点抗体功能的MLR检测具有良好前景，与此类似，该方法同样适用于基于单细胞水平基因表达动力学研究。

除此之外，PrimeFlow 流式RNA分析对于评估感染细胞中的病毒RNA、非编码RNA研究、无抗体验证检测、基因编辑效率验证，以及细胞治疗中一些新型靶点表达鉴定等等应用均是强有力的新型工具。