流式脾脏样本制备

提到小鼠流式脾脏样本制备，相信很多同学们都会不以为意。想当初Dr.赛在做博士生的时候，经手脾脏无数，自认为经（Ye）验（Lang）丰（Zi）富（Da），对这个问题也会嗤之以鼻，这有什么难的？？这还能出什么问题？？今天Dr.赛就带着同学们来捋一捋那些年我们掉过的坑，看看这里面有没有你熟悉的坑！

总体来说，脾脏样本制备共分以下四步：

第一步，摘取脾脏

第一次做实验，没找到脾脏的同学，请默默举起你的小手！小鼠的脾脏位于腹腔左上方，紧靠胃底部的左侧，红紫色，呈长条形（图1和图2）。

腹腔打开之后，可以使用镊子将脾脏摘取出来，新手建议使用弯头镊子，不容易刺穿脾脏。脾脏取出来之后，置于RPMI 1640完全培养基（RPMI 1640基础培养基 + 10%胎牛血清 + 1%丙酮酸钠）备用。如果分离的脾脏细胞还需要培养，可以考虑在完全培养基中添加双抗，降低细胞污染的可能。

图1. 小鼠淋巴结和脾脏分布示意图。

图片出处：Toribio-Fernandez R, Zorita V, Herrero-Fernandez B, Gonzalez-Granado JM. An In Vivo Mouse Model to Measure Naïve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells. J Vis Exp. 2018 Aug 22;(138):58118. doi: 10.3791/58118.

图2. 脾脏在培养基中的示意图。

图片出处：Harada Y, Miyamoto K, Sujino T. Protocol to isolate and enrich mouse splenic naive CD4+ T cells for in vitro CD4+CD8αα+ cell induction. STAR Protoc. 2022 Dec 16;3(4):101728. doi: 10.1016/j.xpro.2022.101728.

第二步，处理脾脏

处理脾脏最常用的是机械解离的方法，主要的方式就是研磨。具体来说，将70微米细胞筛网放在 50 mL离心管上方，将脾脏转移到细胞筛网中，使用注射器柱塞端，捣碎或压碎脾脏，使其通过筛网，然后使用移液器吹打均匀，得到脾脏细胞悬液。文献中还有使用酶消化的方式来进行脾脏细胞解离，对于某些特定细胞类型，比如树突状细胞，酶消化的方式能够改善树突状细胞的释放和得率。

第三步，裂解红细胞

小鼠脾脏中含有约2.5-5×10¹⁰ 红细胞，而白细胞只有约1×10⁸。为了减少红细胞对于白细胞分析可能产生的影响，通常会选择使用红细胞裂解液将红细胞去除。比较常用的红细胞裂解液是以氯化铵为主要成分，通过改变渗透压，将红细胞涨破。

Dr.赛将脾脏细胞水平离心收集（400×g，5分钟）并重悬于5 mL的红细胞裂解液中（eBioscience™ 1X 红细胞裂解液，货号: 00-4333-57），冰上孵育4-5分钟，终止反应后，细胞通过离心收集，重悬于RPMI 1640完全培养基。

红细胞裂解过程中的常见问题：

Q 总是会残留少量红细胞，是否需要裂解完全？

A 红细胞裂解完全通常是不必要的，一方面少量残留红细胞通常不会干扰后续实验，并且可以在流式分析过程中被分析出来。另一方面，完全裂解红细胞往往需要延长裂红时间，增加裂红次数等，这样可能会对白细胞造成一定的影响。如果确实需要进一步去除红细胞，可以再次用红细胞裂解液孵育样本进行二次裂红。

Q 红细胞裂解离心后，发现有一团细胞，无法吹打分散，这是怎么回事？

A 这是红细胞裂解后比较常见的现象，这一团细胞以死细胞为主，细胞死亡造成核酸释放，而核酸比较“粘”，从而形成细胞团。裂红离心之后，需要过滤去除细胞团。如果不去除的话，可能会形成“滚雪球”效应，粘附的细胞越来越多，细胞团也就越来越大。

Q 红细胞裂解液是无菌的吗？

A 这要看具体的产品，非无菌的裂解液可以自行过滤除菌（0.2微米滤膜），也可以选择无菌过滤的ACK裂解液，货号A1049201。

第四步，细胞计数

裂过红的脾脏细胞中以T和B淋巴细胞为主，个头又小，数量又多，人工计数实在是有点困难。现在，Dr.赛使用的是Countess™ 3 FL自动细胞计数器进行细胞计数，又快又准，省时省力。

小鼠脾脏样本制备的常见问题：

Q 小鼠脾脏中有黑斑，是不是小鼠生病了，这个脾脏还能不能用了？

A 以Dr.赛本人的经验来看，有黑斑和没有黑斑的脾脏，没有发现有明显的细胞组成变化。同时，Dr.赛也查阅了很多相关文献，目前认为，黑斑是由于黑色素沉积造成的，对免疫学研究未发现有显著影响，无需过多担心。