优化sgRNA设计的技巧

设计有效的CRISPR实验涉及多个步骤，其中之一就是有效设计单链向导RNA（sgRNA）。sgRNA是可编程序列，可引导核酸酶（如CRISPR-Cas9）到达特定的DNA靶点。高效的sgRNA设计对于执行精确的基因组编辑实验至关重要。

为什么sgRNA设计很重要？

为了优化sgRNA设计，应考虑以下因素：

1. PAM兼容性：原间隔区相邻基序（PAM）是Cas蛋白识别、结合目标DNA并启动切割过程所必需的。不同的Cas变体识别不同的PAM序列（例如，Cas9识别NGG）。确认您的靶点位点包含兼容的PAM非常重要。如果您的靶点缺少所需的PAM序列，可以考虑使用TALENs（转录激活因子样效应物核酸酶）来实现您的编辑目标。TrueDesign Genome Editor也可以为感兴趣区域设计TALEN对。
   
2. 靶向活性：sgRNA的效率由其序列、周围DNA环境以及其他特征决定，如sgRNA:DNA熔解温度、折叠间隔区序列的最小自由能和染色质可及性。基于这些因素，已经开发出多种机器学习算法，用于预测sgRNA的靶向活性。在设计针对目标区域的sgRNA时，预测出的靶向活性评分可以帮助用户选择最佳sgRNA。在TrueDesign Genome Editor中，我们使用Rule Set 3 ^[1]来确定靶向评分。
   
3. 脱靶活性：在设计过程中还应评估sgRNA的脱靶谱。这包括扫描目标基因组中与目标序列相似的区域。脱靶搜索应考虑错配，因为像Cas9这样的核酸酶允许sgRNA即使存在错配也能结合，从而导致意外编辑。此外，Cas9还能识别NAG和NGA等替代PAM序列，这些也应纳入脱靶分析，以全面评估潜在的脱靶效应。TrueDesign Genome Editor通过允许sgRNA序列最多有3个错配，并包含NGG、NGA和NAG PAM序列来评估脱靶位点。TrueDesign Genome Editor使用切割频率判定（CFD）评分^[2]对脱靶位点进行评分，并注释脱靶位点的位置，指明其是否位于基因的外显子或内含子，以及该基因是否为癌基因或肿瘤抑制基因。这些细节可以帮助用户选择具有较少脱靶位点的sgRNA、具有低CFD评分的脱靶位点的sgRNA、具有内含子或基因间区脱靶位点的sgRNA，或这些因素的组合。
   
4. 距离编辑位点：目标序列距离期望编辑位点的灵活性取决于实验类型。对于敲除实验，理想情况下应将sgRNA设计为针对基因早期外显子的序列。对于敲入实验，应将sgRNA设计为尽可能靠近期望插入位点。除了sgRNA活性之外，敲入效率还取决于敲入片段长度以及插入位点与sgRNA切割位点之间的距离。对于同源臂较短的插入序列，如果sgRNA切割位点距离插入位点超过10 bp，则敲入效率较低。然而，对于同源臂较长的序列，即使切割位点距离期望插入位点达40 bp，也能获得更高效率。
   
5. 变异重叠：使用参考基因组设计的sgRNA可能由于遗传变异而降低有效性和特异性。遗传变异可能导致PAM位点被破坏、新PAM位点产生或在目标序列中引入错配。因此，在设计sgRNA时，应考虑特定目标人群（如已知）或整体人群中的遗传变异情况。TrueDesign Genome Editor可在引导设计过程中轻松可视化遗传变异，并允许用户在进行脱靶搜索时包含遗传变异信息。

验证sgRNA设计

虽然可以使用多种算法来设计并选择最佳引导RNA，但最终通过功能测试才是最权威的方法用于验证。算法旨在具有预测性，但诸如细胞环境和递送方式等因素会显著影响sgRNA的效率。我们建议对您的sgRNA进行功能性测试。

验证是确保您的sgRNA功能性的关键。在测量sgRNA效率时，拥有合适的阳性、阴性和递送对照组至关重要。可以通过多种方式测量sgRNA的效率：

1. T7核酸酶检测法：可使用Invitrogen GeneArt基因组切割检测（GCD）试剂盒快速且可靠地确认您的sgRNA编辑效率。TrueDesign Genome Editor会为您选择的sgRNA设计GCD引物。
   
2. 测序：Sanger或下一代测序可用于确定sgRNA的效率以及目标区域的编辑类型。插入或缺失导致移码突变或剪接位点破坏可能导致基因敲除。如果进行敲入实验，测序可以确认预期模板是否成功插入到目标位置。TrueDesign Genome Editor也会为编辑位点的测序设计引物。
   
3. 流式细胞术：在由于基因组编辑而预期出现特定表型变化的细胞中，可以使用荧光标记的抗体或报告基因来验证sgRNA的编辑效率。

结论

设计和验证有效的sgRNA对于执行准确高效的CRISPR实验至关重要。遵循建议的sgRNA设计注意事项和验证步骤有助于确保创建出有效的sgRNA。为简化sgRNA设计，赛默飞世尔科技提供了一个免费的平台，用于构建sgRNA和基因编辑实验——TrueDesign Genome Editor（基因组编辑器）。这个基因组编辑设计工具结合了优化sgRNA设计所推荐的注意事项，并提供脱靶评估与验证支持，使研究人员能够轻松精准地构建sgRNA。请访问thermofisher.com/truedesign（赛默飞官网）了解更多信息。如需观看如何使用TrueDesign Genome Editor的视频教程，请在此浏览相关播放列表。

仅供科研使用。不得用于诊断程序。

参考文献

[1]  DeWeirdt, P. C., et al. (2022). Accounting for small variations in the tracrRNA sequence improves sgRNA activity predictions for CRISPR screening. *Nature Biotechnology, 40*(4), 570-578. https://doi.org/10.1038/s41587-021-01107-5 

[2] Doench, J. G., et al. (2016). Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. *Nature Biotechnology, 34*(2), 184-191. https://doi.org/10.1038/nbt.3437