实时荧光定量PCR(qPCR)中Ct值的理解

作者：John Pfeifer

实时荧光定量PCR（聚合酶链式反应）是一种在每个PCR循环后检测特定基因序列扩增的技术。这项技术可以用于检测或定量多种应用中的基因序列。

实时荧光定量PCR分析包括一组寡核苷酸，用于扩增和检测特定的基因靶标。实时荧光定量PCR分析通常由两个PCR引物和一个带有荧光标记的探针组成，这种探针被称为TaqMan探针。

实时荧光定量PCR测试或实验通常设定为运行40个循环，但高价值的数据只涵盖少数几个循环，并且这些循环在不同样本之间可能有所不同。如何从实时荧光定量PCR数据中筛选出高价值的数据点？

扩增曲线图

实时荧光定量PCR数据通常以一种称为扩增曲线图（见图1）的方式表示。纵轴单位为荧光值，测量值常被称为ΔRn，即经过基线扣除并标准化后的报告信号。横轴则表示PCR循环次数。

基线定义为早期PCR循环中，在扩增信号尚未可检测到之前的数据。在纵轴采用线性刻度的扩增曲线图中，基线应表现为一条平直的线。在基线周期内，目标基因可能已经开始扩增，但报告信号（如来自TaqMan探针）尚未积累到足以被观测到的程度。如果反应体系中存在目标序列，最终扩增信号将会从基线上升出来。

图1

基因定量

实时荧光定量PCR是基因定量的金标准。其原因在于指数期扩增具有极高的一致性。指数期（也称为几何期、对数期）是PCR的第一个阶段，此时所有反应物——如引物、DNA聚合酶、dNTP等——都处于过量状态，从而保证了扩增效率的一致性。这种一致性意味着，PCR反应中初始目标基因的数量将决定扩增信号何时从基线中显现，如图2所示。起始目标数量越多，扩增信号出现得就越早。

每个扩增曲线需要一个高价值的数据点来计算初始目标数量值。基线数据点没有定量价值。指数期的数据点价值最大。当某一反应物不再足以维持一致效率时，指数期结束，随后的数据点价值降低。因此，需要一种方法，在一致的位置选择指数期数据点，以便在同一次实验中具有可比性。

图2

Amplification plot showing how target quantity affects signal emergence from baseline

Ct值

从实时荧光定量PCR扩增曲线获得的单个数据点被称为阈值循环或“Ct”（也称为Cq）值。最早且仍然最常用的Ct值产生方法被称为基线-阈值法。

在所有实时荧光定量PCR化学体系中，总会存在一定的基线荧光，并且不同孔之间可能略有差异。通过实时荧光定量PCR软件中的基线扣除算法，这种差异大大减少，该算法将所有基线设定为约零。通过将所有基线设为零，阈值就能从统一的起点设置。

阈值是针对某一实验选定的荧光值（ΔRn），用于计算Ct值。阈值通常设置在PCR的指数期内。在放大曲线上，用对数坐标y轴最容易识别出指数期，此时各条曲线表现为斜率相同的平行直线（见图3）。在扩增曲线上，阈值表现为一条水平直线。

阈值与扩增曲线相交的位置即产生Ct值。Ct值通常不是整数。

图3

Amplification plot showing exponential phases

定性结果

Ct值可用于定性检测，例如判断病原体的存在或不存在。没有Ct值意味着该反应中未检测到目标物，出现Ct值则表示目标物存在。

定性检测通常包含一个对照基因，用于质量控制。如果对照检测的Ct值过高，则目标阴性样本结果的有效性将受到质疑。例如，可能在样本采集、提取过程中出现了问题，或者存在抑制剂等情况，这些都可能导致检测灵敏度低于可接受水平。

对于定性检测，为了保证每次实验运行时Ct值计算的一致性，阈值通常是固定的。

定量结果

定量结果有多种类型：相对与绝对，以及数量与浓度。在实时荧光定量PCR软件中，“quantity”（数量）一词被广泛用于涵盖所有这些结果类型。

实时荧光定量PCR中的绝对定量是指确定目标分子的实际数量或浓度；而相对定量则是用非分子或任意单位来确定数量。

不建议将Ct值作为最终的定量结果进行报告，因为Ct值是抽象、不完整且数学上较为复杂的数据。仅有Ct值在定量上是不完整的，因为其定量解释依赖于指数阶段效率。例如，Ct标准差并不像普通标准差那样表现。

定量结果应以“数量”形式报告，这是一种完整且数学上更简单的数据点。“数量”可以通过Ct值和指数阶段效率计算得出：

公式1

Quantity ~ e^-Ct

Where:

数量 = 初始目标基因数量

e = 指数期效率，理想值为2（目标每个循环翻倍）

Ct = 阈值循环数

涉及生物样本的实时荧光定量PCR定量通常包括一个标准化基因。该基因用于测量样本质量，并通过样本质量对目标量进行归一化，以获得具有生物学意义的目标浓度。

校准是定义数据集单位的一种方法。在实时荧光定量PCR中，一个常见做法是使用某个样本或一组样本的平均值作为“校准器”（也称为参考样本或参考组）。校准器样本或组的相对数量（RQ）设为1，其他所有样本的RQ值都以此为参照。校准器可以是相对的，也可以是绝对的。

在1997年名为“用户公告#2”的文件中，方程1被修改用于样本质量归一化和校准，并将指数效率设定为100%。由此得到的公式被称为比较Ct或ΔΔCt方法：

方程2

相对数量 = 2^-ΔΔCt

Where:

ΔΔCt 是通过样品质量归一化并校准后的 Ct 值。

注意，Ct 值的归一化是通过减法而不是除法进行的，符号 Δ 表示减法。

对于定量检测，可以在指数阶段的 ΔRn 值范围内设置阈值（见图4）。在以对数 y 轴显示的扩增曲线中，指数阶段结束于曲线开始向右弯曲的位置。由于精确度降低，阈值不应设置在该弯曲区域。此外，阈值也不应设置得过低，否则数据会表现出更大的变异性。这种变异性是由信噪比低造成的。

调整阈值会改变该检测的 Ct 值，但如果阈值设置在推荐范围内，则 Ct 值变化是一致的。在使用 ΔΔCt 方法时，一致的 Ct 值变化不会显著影响最终结果数量。

不同检测之间不要求使用相同的阈值，但如果每个检测都适用，该阈值也可以为了方便设为相同。

建议通过扩增曲线图对阈值进行目视评估，以确保其处于可接受范围，即使采用自动阈值算法也是如此。图4

相对阈值法

一些实时荧光定量PCR软件程序提供了一种计算Ct值的替代方法，称为相对阈值法。该方法是自动化的，因此无需评估或修改基线或阈值设置。该算法会识别可能的扩增信号，并根据每个扩增曲线的形状在一致的位置计算Ct值。使用相对阈值法时，Ct值将在软件中显示为“Crt”值，以标识所采用的方法。

实时荧光定量PCR软件会计算质量控制数值，这些数值可能包括Cq置信度、扩增评分和扩增状态。建议评估这些质量控制数值，以确保Ct这些数值来自真实的扩增反应。

等效Ct值

除了Ct值之外，一些实时荧光定量PCR软件程序还会显示“等效”Ct值，即如果检测具有100%指数期效率时应有的Ct值。如果检测效率在软件中保持默认的100%，则Ct值与等效Ct值将完全一致。

只有在极其谨慎的情况下才应将检测效率从默认的100%更改。常见的一种计算指数期效率的方法是基于标准曲线斜率，但标准曲线斜率会随机波动。建议仅使用具有100%指数期效率的检测进行实时荧光定量PCR，因为低效率检测会带来不必要的复杂性。例如，如果某一检测效率较低，则准确测量其效率将变得困难。此外，为了保持灵敏度，实时PCR常规使用的40个循环次数也需要增加。

本文仅浅析了实时荧光定量PCR（qPCR）的基础内容。如需了解更多信息，请访问以下有用资源：