EVOS解锁新方法：一步法精准腺病毒滴度检测

疫苗研发、基因治疗、生物制药、细胞治疗、抗病毒药物与诊断试剂——EVOS M7000智能成像系统为病毒滴度检测精准护航，加速创新转化！

关于病毒载体和疫苗的定量分析

关于病毒载体和疫苗进行准确的定量是任何后续病毒制剂使用前必须完成的关键步骤，传统的基于免疫细胞化学的方法用于腺病毒定量已被广泛应用，但要提高其准确性和效率，以减少病毒误判和疫苗材料的浪费，仍有诸多改进空间。病毒载体和疫苗的定量分析是评估生物体性能和适应性的必要步骤。这一定量过程可能会在时间资源方面造成极大的压力，成为病毒载体和疫苗生产中的一个显著瓶颈，决定着所有后续实验的进程和时间安排。这包括迫切需要开发并实施能够在短时间内实现的准确且精确的病毒定量方法，从而加快后续应用，特别是在体外和体内给药方面的应用。这种量化在理解病毒载体的临床相关性和临床剂量方面具有至关重要的意义。

因此，病毒滴度测定一直处于量化工作的前沿，它为深入理解病毒在特定细胞中的适应性、复制过程或循环机制提供了重要见解。病毒的“活性”可定义为感染倍数（MOI），其体现为病毒颗粒数量与宿主细胞数量的比率。在腺病毒定量分析中，一个关键点在于每毫升的感染单位数（Ifu/mL）或每毫升中诱导目标细胞感染的感染性病毒颗粒数量。尽管这种传统方法具有特异性，但其执行成本非常高，涉及诸多变量，尤其是时间、资金（包括试剂和资源成本）以及对操作人员等方面的严格要求等。

近日由芬兰赫尔辛基大学科研人员采用了一步法创新方法来优化腺病毒定量分析，该方法使用单一抗体与自动化、高通量图像采集以及后续批量分析相结合。首先，将目标腺病毒感染细胞，并使用六聚体蛋白对其进行染色。然后通过 Invitrogen EVOS M7000 成像系统实现了多通道自动图像采集。最后，通过 EVOS Celleste6.0分析软件对采集到的图像进行了自动大规模分析，这一过程是通过对软件的精确训练来完成的，能够实现病毒感染量的量化以及诸多其他参数（计数、圆度、面积和靶标信号强度）的测定。研究发现，与传统方法相比，该一步法能够在时间和资源上更高效地实现对肿瘤溶瘤病毒疫苗和基因治疗载体的精确量化分析。

当前首选方法（病毒滴度测定法）的成本效益分析：

当前的病毒滴度测定是通过将探针与针对病毒六聚体蛋白的抗体进行偶联来实现的。六聚体是病毒感染后表达的晚期基因，在宿主细胞破裂前起着至关重要的包装所需蛋白质的作用。这种蛋白质的表达与任何给定病毒制剂或后续实验中完全功能的病毒量呈直接正相关。通常检测六聚体蛋白需要一个双抗体系统，包括一种鼠源性抗六聚体抗体，随后由带有生物素 SP 连接探针的抗鼠次级抗体识别（图 1）。这一过程最终会生成一种有色沉淀物，这种沉淀物可以通过分光光度法进行定量分析，从而能够确定六聚体蛋白的含量，进而得出载体或疫苗制剂中功能性病毒的含量。

图 1.优化后的 ICC 方案及其优势

优点包括减少资源消耗（时间、资金和材料方面），实现自动化和高通量分析，以及提高精度和准确性。图示部分展示了传统的 ICC 方法，包含一个双结合抗体系统，需要依次进行给药并手动获取图像和分析，这是一种低效率的方法，图像采集和分析所需的时间会随着数据点数量的增加而呈指数级增长。

一步法方案涵盖了所提出的优化方法，包括单抗系统、自动化图像采集以及大规模批量分析。这是一种高通量的方法，能够及时获取并分析大量数据，从而实现更精确和可重复的病毒定量。需要指出的是，每个箭头代表了重复进行的洗涤步骤，这也极大地增加了执行病毒定量过程所需的时间。该图像由 BioRender 创建。

尽管 ICC 方法适用于病毒滴度测定，但该方法本身在准确性、资源消耗等方面仍有许多需要改进的地方。通过这种传统方法进行病毒滴度测定对用户所需的时间要求较高，而且其能否成功完成还需要耗费较大成本以及相关试剂的投入。本研究探讨了一种采用自动图像采集和分析的一步法方案，旨在确保数据精确性的条件下改进传统的滴度测定方法。

快速且自动化的高通量病毒检测方法

在这项研究中，研究人员提出了一种高通量的方法，其实施有望显著提高病毒生产过程中病毒滴度测定的效率、精度和准确性，无论是在学术领域还是工业应用中都是如此。这包括对单抗系统的深入分析（FITC标记）、直接荧光报告基因定量验证的实施，以及通过使用EVOS M7000 成像系统实现的最新自动化图像采集和分析技术。这种优化的方法能够极大减少资源消耗，同时通过减轻传统ICC中多种偏差（包括用户偏差和采样偏差）来提高精度和准确性。在本研究中，通过对肿瘤溶解疫苗和基因治疗载体的定量分析，强调了该方法对不同病毒载体和疫苗的准确度、精度和适用性的优势。

建立优化的病毒滴度测定方法

在本研究中，对两种可能对常规病毒滴度测定方法进行的优化方法进行了协同效果的比较研究：（1）采用一步抗六聚体抗体系统；（2）采用先进的显微镜和分析技术。作为概念验证评估，将 70%贴壁的人肺癌细胞系 A549 细胞感染内部克隆的 Ad5D4RFP，并进行染色；在感染后 48 小时对所得细胞进行成像。研究人员提及：该病毒的实施作用在于能够直接与用于检测和定量病毒感染的 Hexon 蛋白染色进行对比，以检测转基因的表达情况。图像是在多个通道上同时获取的，并经过去卷积处理以分离为不同的文件，每个文件对应一个通道以便进行单独分析（图 2A）。单独分析每个通道或将其组合起来进行分析，能够实现多种应用类别的分析。通过将 Hoechst 染色作为细胞总数的基准， FITC 或RFP检测到的细胞数量除以细胞总数，可以准确评估感染过程。通过使用公式对这些值进行直接计算，并在图 2A 中可见，可以得出感染百分比。将该数据与滴度一起使用能更准确地衡量病毒的效力，并可指导更准确的实验设计。基于图 2B 中的总感染计数、感染率和滴度，这种分析形式中还可以获得大量的其他测量值，从而提供了更丰富且有价值的信息。

图 2.特定染色后的多通道自动图像采集

将 A549 细胞以 100 倍感染量感染 Ad5D24 细菌 48 小时后进行成像。采用核染色方法结合 FITC 单体系统，以实现更精确的滴度测定过程，并通过核染色剂 Hoechst（作为总细胞数的估计值）和 FITC（作为总感染数的估计值）来确定感染率。（A）基于显微镜通道的采集数据解析，将多通道整管图像分离到各自的通道中。通过 EVOS 分析软件，可以对每种荧光染色剂的计数进行获取。（B）单通道分析涉及通过公式 2（方法说明）对目标计数进行操作，并与总体细胞计数进行比较，从而创建感染百分比指标。从整个孔图像中，通过公式 2 可以确定高度准确的感染滴度。（C）该仪器的其他可量化指标包括每个斑点的强度、圆度和面积，所有这些都提供了有关这些目标的感染状态的重要信息。图像通过 EVOS M7000 成像系统在手动采集操作规程下获取（每孔 40 张图像，每种条件 3 个重复孔）。统计学分析为常规的一元方差分析，各孔之间的标准差已给出。所示的是平均值±标准误，显著性水平设定为 *p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001（95%置信区间）。

全孔图像采集与滴度测定

除了采样之外，全孔成像还是一种强大的病毒滴度测定方法。它使用户能够在分析时考虑孔的整个表面，并避免分布和采样偏差。EVOS M7000 成像系统能够以精确且高效的方式获取高分辨率图像，并进行自动拼接以生成全孔图像（图 3）。

图 3. 整井成像技术用于准确测定病毒滴度

使用 M7000 成像系统在 10 倍放大倍数下，对整个标准的 24 孔板（每种条件 3 个重复孔）进行同时成像，采用自动采集操作规程。每个通道生成的拼接图像分别进行处理，并在单个通道级别上进行分析。从孔边缘（细胞融合度低于 50%）捕获的图像被排除在分析之外。通过 EVOS 分析和 Celleste 6.0软件的联合应用，对图像进行分析，包括病毒滴度的测定。进行的统计分析为普通的一元方差分析，并报告了标准差。所示的是平均值±标准误以及在孔之间设定的显著性水平：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001，****p < 0.0001（置信区间 95%）。

同时进行的多通道采集提供了丰富的数据，包括常规有色沉淀物（透射）、转基因产物（红色荧光蛋白）以及六聚体产物（绿色荧光蛋白）的数据。这使得能够直接计算并比较不同方法的滴度，总体上是以单个样本为基础进行的（图 3）。通过优化的一步法获得的滴度最高，为 1.56 乘以 10 的 10 次方，并且与同类方法相比具有更显著的统计学意义，表明这种方法在信号检测的灵敏度和最终滴度的准确性方面具有更高的准确性。另外两种方法的滴度值与已报道的值（分别为 1.37 乘以 10 的 10 次方和 1.24 乘以 10 的 10 次方）具有较高的相似性（图 3）。总的来说，在根据四步法的转基因产物来测定病毒滴度时，未发现有已报道的差异，而优化的一步法则在统计学上更高。

通过溶瘤腺病毒追踪癌细胞的杀伤情况

基于多通道获取图像的高效方法，可按时间顺序可视化分析其在病毒感染后的扩散情况。在腺病毒中，监测感染后的前 72 小时对于了解感染的关键时间点具有重要意义，这对所有后续应用和实验非常有益。将优化的方案与 EVOS M7000 成像系统相结合，使这项任务变得非常简单。病毒感染的首次出现迹象在 24 小时后明显显现，所有标记通道的信号显著增加，分别记录的平均计数为 RFP 38.06、FITC 38.15 和抗 Hexon 传输 40.12（图 4B）。所得的荧光强度在不同时间点上呈现出稳定的增加趋势，在 48 小时时分别达到 RFP 和 FITC 荧光指示剂的平均最大值 1762.58 和 497.73L/mm（图 4A 和 4C）。在 72 小时时间点，由于细胞从板上脱落和细胞溶解，出现了显著的下降。随后的图像分析显示了感染细胞计数、强度的相同趋势。并且目标的循环性表现为首次出现的时间为 24 小时，在 48 小时时观察到最大效果，随后在 72 小时出现显著下降（图 4B 和 4C）。在进一步计算的值中，包括目标的面积、滴度和总体感染率（图 4B），总体趋势保持不变。综合来看，这种新的一步法方法能够与以前的方法相比，为腺病毒感染后的最初 72 小时提供了更深入和准确的数据。

在 96 孔板上重复进行了相同的实验，以充分利用该容器的固有优势（所需试剂量较少，可分配更多孔位以设置更多时间点，经济上更划算），从而能够获得更多的时间点，以便更清晰地阐明病毒复制周期的各个阶段。

为了具体说明这种方法在正常细胞中对传染性的适用性，我们使用了 Ad5ddTomato 对 Hek293 细胞进行感染的实验。在 96 孔板上重复实验获得了相似的数据和趋势，能够准确地在整个复制周期内定量非肿瘤溶解型病毒（图 S1B）。这一点通过转基因得到了体现。在 24 小时时达到生产峰值，第 4 天达到最大信号强度，而到第 5 天（即病毒复制周期结束时）信号强度则显著下降（图 7）。

病毒滴度测定容器比较

通过对感染后 72 小时内各种病毒的跟踪观察，发现采用更高容量的容器来同时评估更多的变量是有利的。为了全面了解这将对所获得数据的准确性（即感染细胞的百分比）产生的影响，我们对 24 孔板和其 96 孔对照板进行了完整的容器比较。

图 4. 在标准容量培养皿（24 孔）中追踪感染后 72 小时内溶瘤病毒的感染进展情况

根据文献中的标准间隔获取多通道图像，以追踪 Ad5D24 病毒感染（100 MOI）在 A549 细胞中的扩散情况。（A）在标准 24 孔培养皿中获得的完整图像集，报告了 DAPI、GFP、RFP 和透射（Trans）通道的图像，并展示了所有这些通道的代表性叠加图像。这些图像使用 EVOS M7000 成像系统在自动采集中获取（每孔 40 张图像，每个条件 3 个重复孔）。（B）通过显微镜成像分析获得的指标，展示了病毒的进展情况。使用 EVOS 分析软件对每种荧光染色物进行计数（C）通过使用（B）中先前获取的指标以及材料与方法部分所讨论的后续方程进行计算，获得了更多有关病毒感染的测量数据。章节。所进行的统计分析为常规的双因素方差分析，各孔之间的标准差予以报告。所示内容为平均值±标准误，显著性水平设定为*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 和 ****p < 0.0001（置信区间 95%）。

图 5. 病毒杀瘤感染 72 小时后的感染情况追踪（在容量更大的容器（96 孔板）上进行）

通过与图 4 中所描述的相同方法获取了多通道图像，并针对该容器的较大容量增设了额外的时间点。（A）在 96 孔容器中获得的完整图像集，报告了在 DAPI、GFP、RFP 和透射通道中获取的图像，并配有相应的叠加图。这些图像使用 EVOS M7000 成像系统在自动采集程序下获取（每孔 10 张图像，每个条件 5 个重复孔）。

图 6. 在标准容量培养皿（24 孔）上追踪感染后前 5 天非肿瘤病毒感染的进展情况（24 个孔）

根据文献中的规定，在关键时间点获取多通道图像，以追踪 Ad5ddTomato 这种非肿瘤病毒的感染扩散情况。（A）在标准 24 孔培养皿中获得的完整图像集，报告了 DAPI、GFP、RFP 和透射通道所获取的图像，以及所有这些通道的代表性叠加图像。这些图像使用 EVOS M7000 成像系统在自动采集程序下获取（每孔 40 张图像，每个条件 3 个重复孔）。

图 8. 不同容量容器中百分比感染率计算准确性的比较

使用低容量和高容量容器评估 Ad5D24 病毒对 A549 细胞的感染能力（100 MOI，持续 48 小时）时所获得的准确度测量值。

（A）低容量和高容量容器中培养皿相对表面积的示意图，该示意图在五张图像中呈现，分别记录了低容量和高容量容器的数据。通过容器制造商的规格（24 孔，1.93 平方厘米；96 孔，0.33 平方厘米）计算出的培养皿表面积百分比，并通过 EVOS 分析标尺进行标准像素转换。图像改编辑自 BioRenderª2024。（B）每个培养皿的五张多通道图像所得到的感染率百分比。图像采集使用 EVOS M7000 成像系统，在自动采集操作程序下进行。在 EVOS 分析软件上进行了荧光染色分析，并通过 Celleste6.0 软件进行了常规的四步 ICC 方法来源的数据分析。

优化后的病毒滴度测定

MOI（感染强度）和病毒定量也是在优化方案中用于确定病毒滴度的主要方法，也是本研究的主要内容。优化方案由一步法及单抗系统组成，旨在病毒感染后再次针对新合成的六聚体蛋白进行检测。细胞固定的操作方式与上述常规病毒滴度测定方案相同。使用了腺病毒六聚体单克隆抗体、FITC（MA1-7329，Thermo Fisher Scientific，1：100，在室温下作用 1 小时）并按照指导进行操作。所有其他方案，包括细胞接种、感染后数小时的检测以及 Hoechst 染色，都与常规方案保持一致。通过显微镜直接观察到 FITC 的生成，从而省去了酶和底物系统的使用。对于在不同时间点进行了感染、固定和染色的操作，其步骤与上述常规病毒滴度测定方法完全相同。

显微镜观察与定量分析

在 EVOS M7000 成像系统（Thermo Fisher Scientific）上对病毒感染进行了显微镜观察，该系统能够获取显示有彩色沉淀（或 FITC）的感染细胞的图像，这些图像分别在透射光和绿色荧光蛋白（GFP）通道中获取。亮度、聚焦和每张图像的计数等设置是手动设定的，每张图像的目标数量（感染细胞）被设定在 10 到 100 之间，并通过之前的感染时间和 MOI 进行优化。经过手动校准后，进行了自动图像采集，以获得每个孔的 n 张图像，跨越多个通道。本研究的自动图像采集包括透射光（用于常规的彩色沉淀产物）、红色荧光蛋白（转基因产物）、绿色荧光蛋白（FITC）和 DAPI（Hoechst），每张孔中有 40 张图像用于采样，整个孔有 192 张图像。图像以随机顺序获取，并在所有孔的相同位置随机选择以供所有实验使用。所得的图像通过图像拼接技术将各个部分组合在一起，以生成不同状况下的整孔图像。感染率指标是通过将荧光阳性细胞的总计数（来自显微镜观察，以 RFP 作为转导单位或以 GFP 作为抗六聚体）除以细胞总数（通过核染色（Hoechst 染色）来表示。

综合来看，该项研究中将荧光滴度检测与全自动高通量采集与分析相结合的方法，相较于传统的滴度检测方法具有诸多优势。其中最显著的优势包括能够提供更全面和准确的病毒滴度测定，同时还能节省资源消耗以实现精准病毒定量。该一步法归功于方法设计中的诸多改进，包括其具有高通量数据采集和分析能力，能够以更快的速度进行更多的数据分析，并在培养皿的整个表面获得更全面、更完整的数据信息。这避免了传统病毒定量方法中存在的显著的采样偏差影响，进而获得更精确的计算和分析结果。另外也兼容更多的容器类别，而无需其他额外的投入，这也体现了该方案的高通量特性以及它所带来的经济性和可操作性。