Por Dr. Scott Peterman, Gerente Senior de Marketing de Producto, Espectrometría de Masas en Ciencias de la Vida, Thermo Fisher Scientific
Parte 4: Más allá de las 4 dimensiones para mejorar el rendimiento analítico en análisis cuantitativo dirigido
Esta es la cuarta entrega de una serie de blogs que destacan los atributos clave y los impresionantes beneficios del espectrómetro de masas Thermo Scientific™ Stellar™, el primer instrumento de su tipo diseñado y optimizado para cuantificación dirigida altamente multiplexada, ideal para verificación de descubrimientos. Al ofrecer métodos analíticos robustos y tiempos de respuesta significativamente mejorados, esta solución ayuda a los laboratorios a aumentar su capacidad y diferenciarse, generando así mayores ingresos. Para conocer más antecedentes, consulte la Parte 1, Parte 2 y Parte 3 de esta serie, y permanezca atento a futuras publicaciones en nuestro sitio web.
Más allá de las 4 dimensiones para mejorar el rendimiento analítico en análisis cuantitativo dirigido
La especificidad analítica es uno de los requisitos más críticos para un análisis cuantitativo dirigido exitoso. Asignar los datos medidos a iones producto diagnósticos del analito de interés aumenta la confianza en la medición resultante al determinar el nivel de expresión, número de copias o cantidad absoluta de un analito en cada muestra, así como en todo el estudio. El uso de valores determinados empíricamente para cromatografía líquida (LC) y espectrometría de masas (MS) proporciona información específica que, en conjunto, mejora el procesamiento de datos. Esta información ortogonal incluye: 1) tiempos de retención y formas de pico cromatográficos; 2) valor m/z del precursor; 3) iones producto MS/MS; y 4) perfiles de distribución de iones producto MS/MS, que pueden almacenarse en bibliotecas espectrales utilizadas no solo para procesar datos LC-MSn, sino también para construir métodos de adquisición dirigidos con alta confianza.
Determinación de parámetros 4D: ¿es suficiente?
Publicaciones anteriores destacaron el uso de parámetros en cuatro dimensiones (4D) para crear y procesar datos dirigidos y no dirigidos con confianza. Usando LC acoplada a un espectrómetro de masas QTOF con movilidad iónica atrapada (timsTOF), cada analito se anota por medio de cuatro mediciones empíricas en todas las muestras del estudio: 1) tiempo de retención medido; 2) movilidad iónica como medida de su sección transversal de colisión (CCS); 3) valor m/z del precursor; y 4) presencia de iones producto correspondientes. Se asume que la selectividad ortogonal lograda mediante la separación UHPLC y la resolución de movilidad iónica es suficiente para diferenciar un analito específico de iones isobáricos e isoméricos coeluyentes, y que los iones producto resultantes se atribuyen solo al precursor aislado. Agregar valores de CCS puede ayudar a compensar cierta variabilidad, pero requiere mayor trabajo del investigador para determinar con precisión la varianza asociada a la movilidad iónica. En ningún punto se emplean las relaciones de iones producto como una dimensión adicional para verificación.
Un complemento inteligente: determinación de relaciones de iones producto
Sin embargo, la determinación de relaciones de iones producto ha sido el estándar de oro para análisis cualitativo en adquisiciones SRM/MRM durante décadas. A pesar de que los métodos cuantitativos en espectrómetros de masas de triple cuadrupolo adquieren datos de solo dos o tres transiciones de iones producto, la inclusión de las relaciones entre estos iones se utiliza para verificar cualitativamente que la señal medida corresponde al analito de interés. Este concepto ha sido incorporado en los estudios de cuantificación dirigida realizados con el espectrómetro de masas Thermo Scientific Stellar™, aumentando significativamente el rendimiento analítico para una amplia gama de moléculas.
Para mejorar la selectividad y especificidad cuantitativa necesaria para una adquisición confiable de datos, la solución propuesta combina las capacidades de separación cromatográfica del sistema Thermo Scientific™ Vanquish™ UHPLC con la innovadora adquisición PRM del Stellar™, y va más allá de la confianza en el procesamiento de datos. Adicionalmente, se aprovecha una adquisición de datos inteligente que permite alineación de tiempo de retención (RT), reduciendo la necesidad de aplicar pasos adicionales de procesamiento posterior. Este blog analiza la diferenciación en cada uno de estos pasos, al tiempo que presenta una quinta dimensión importante: la ampliación del análisis PRM hasta el nivel MS3.
Dimensión 1: Aprovechamiento de UHPLC de 1.500 bar para selectividad ortogonal
Con los sistemas Thermo Scientific Vanquish™ Neo y Horizon UHPLC, los investigadores pueden aprovechar capacidades de alta presión que cubren un rango desde flujo nano hasta flujo analítico, lo que incrementa la capacidad de pico y mejora la tasa de utilización frente a sistemas HPLC limitados a 1.000 bar. Los sistemas Vanquish también garantizan un rendimiento reproducible a lo largo de estudios prolongados, como los de salud poblacional.
Más allá de la primera dimensión: La rutina Adaptive RT permite asignar valores reales de tiempo de retención a cada analito con ventanas más estrechas. Funciona para moléculas pequeñas y grandes, desde análisis de célula única hasta análisis a granel, y conecta métodos entre gradientes largos de descubrimiento y gradientes rápidos de cuantificación dirigida, sin requerir estándares de RT añadidos. La alineación de RT se realiza durante la adquisición, no en el procesamiento posterior.
Dimensión 2: Introducción de analitos dirigidos
Luego de la separación UHPLC y la ionización, los analitos dirigidos (precursores) ingresan al MS y atraviesan la trayectoria iónica hasta el detector. El filtro de masas cuadrupolar (Q1) transmite un rango estrecho de m/z centrado en el valor m/z del precursor. Este rango suele ser de 1 a 2 Th, dependiendo del espectrómetro de masas.
Más allá de la segunda dimensión: El cuadrupolo QR5 Plus del Stellar™ utiliza varillas hiperbólicas que mejoran la eficiencia de transmisión iónica en un rango más amplio de m/z. La resolución unitaria es de 0.7 Th en la base, mucho más estrecha que los 1.2 a 2 Th de otros cuadrupolos, lo que mejora el rendimiento cuantitativo.
Dimensión 3: Adquisición de datos PRM de más iones producto
El Stellar™ adquiere datos PRM en espectros de barrido completo MS2 por cada evento, a diferencia de la adquisición SRM/MRM. Recoger datos de más iones producto por unidad de tiempo mejora la especificidad de la medición. Además, permite seleccionar iones específicos para cuantificación durante el procesamiento sin necesidad de modificar el método experimental ni repetir el análisis.
Más allá de la tercera dimensión: El Stellar™ combina capacidades únicas de gestión dual de paquetes iónicos con acumulación externa a la trampa iónica, incrementando el rendimiento cuantitativo. Manejar dos paquetes simultáneamente permite tiempos de acumulación más largos sin comprometer la tasa de adquisición PRM, esencial para mediciones en niveles LOD y LOQ.
Dimensión 4: Evaluar relaciones de iones producto mediante espectros MS2 completos
Como se mencionó, las relaciones entre iones producto se usan en métodos cuantitativos validados para asegurar la selectividad frente a interferencias de matriz o fondo.
Más allá de la cuarta dimensión: La forma, lugar y método de acumulación de iones diferencia la eficacia de cada espectrómetro. El Stellar™ primero filtra el precursor por m/z, luego acumula los iones producto en un multipolo de direccionamiento iónico—como en los Orbitrap™—maximizando la sensibilidad para iones de baja abundancia. Finalmente, se incorpora AGC dinámico que ajusta automáticamente el tiempo de acumulación según el flujo de iones. (Referencia: Plubell et al. BioRxiv)
Dimensión 5: Enfrentando factores que afectan la sensibilidad
La cuantificación dirigida mediante adquisición MS2 puede verse afectada por iones isómeros/isobáricos coeluyentes. Las opciones son modificar los gradientes LC (reduciendo el rendimiento) o usar MS3. El Stellar™ permite adquisición MS3 con velocidades excepcionales (hasta 40 Hz), manteniendo la capacidad de targets y puntos de datos por pico.
Más allá de la quinta dimensión: Además de su velocidad única en MS3, el Stellar™ implementa AGC dinámico para maximizar calidad espectral en un amplio rango dinámico y permite usar HCD o CID en cada nivel MSn. La inclusión de Adaptive RT asegura que los métodos tMS3 funcionen en gradientes rápidos con mayor capacidad de targets.
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