Dynabeads磁珠：技巧与窍门

在这个三篇博客系列的最后一篇中，Ketil Pedersen博士分享了一些使用Dynabeads磁珠的技巧和建议。

Dynabeads Magnetic Beads: Tips and Tricks

Dynabead与免疫沉淀——检测限度

当结合HRP或放射性以及优质抗体时，检测所需的目标物非常少。而使用碱性磷酸酶（ALP）为基础的检测系统时，则需要更多的目标物。如何与PG相关并不容易回答。然而，使用灵敏的检测系统，大多数情况下可以检测到纳克（ng）甚至皮克（pg）范围内的目标物。

Dynabeads Protein G背景介绍

Protein G（蛋白G）被包覆在亲水性磁珠上。如果您的背景是由蛋白介导产生，我们通常建议在偶联和洗涤缓冲液中同时添加封闭蛋白和非离子型去污剂，以减少非特异性结合。

应该选择哪种Dynabead磁珠？

Dynabeads产品选择指南

Dynabeads产品适用于多种分子和细胞应用。不知道从哪里开始？请使用我们的简易选择指南，根据样品类型、目标分子和后续应用，为您提供量身定制的Dynabeads产品推荐。

Dynabeads选择指南

推荐的磁性支架取决于样品体积。如需在线工具来选择合适的磁珠，请参见Dynabeads选择指南。

最多2 mL样品体积：DynaMag-2 货号12321D
最多15 mL样品体积：DynaMag-15 货号12301D
最多50 mL样品体积：DynaMag-50 货号12302D
将磁珠拉至每个孔的侧面。兼容PCR条管及96孔板（200 µL）无裙边和半裙边：DynaMag™-96 Side 123-31D
将磁珠拉至每个孔底部。兼容PCR条管及96孔板（200 µL）无裙边和半裙边：DynaMag™-96 Bottom 123-32D

Dynabeads及其洗脱条件

温和的洗脱方法包括改变pH值（通常采用降低pH值）、改变离子强度（可以使用高盐浓度缓冲液，如NaI、KI、MgCl、KCl）。请注意，具体操作流程可能需要根据抗体与目标物的亲和力进行优化。包被抗体的Dynabeads可以通过低pH或高盐浓度等温和洗脱方法重复使用多次。洗脱的成功取决于固定化抗体与捕获目标物的亲和力。此外，使用低pH重复利用固定化抗体时，还需考虑该抗体对这种处理方式的敏感性。采用高盐浓度作为洗脱方法可确保磁珠多轮重复使用，但若用低pH，产率通常会在重复几轮后下降。

Dynabeads Protein A 和 Protein G 是否已用BSA预封闭？

没有。Dynabeads是与Protein A或Protein G偶联的，其亲水表面已用BSA封闭。Dynabeads™ Protein G 免疫沉淀试剂盒包含所有用于使用您自有抗体进行IP所需的试剂和缓冲液。

如何阻断Dynabeads Protein A和G上的非特异性结合

使用更严格的洗涤缓冲液进行清洗。
在洗涤缓冲液中添加非离子型去污剂（如Tween® 20或Triton® X-100），浓度范围为0.01–0.1%。
如果磁珠在沉淀前已被封闭，请在洗涤缓冲液中添加相同类型的封闭剂。
增加洗涤步骤的次数。
延长洗涤步骤的时间。
缩短孵育时间（磁珠和样品）。
尝试间接法。
降低抗体浓度。
可以进行预清除步骤，以去除非特异性结合到Protein A/Protein G或磁珠本身的分子。

Dynabeads Protein A和G——即使交联后抗体仍然脱落。

交联永远无法达到100%。部分抗体未被交联，可能在洗脱过程中脱落。
交联后立即用低pH进行洗涤，以去除未交联的抗体。记得在免疫沉淀前将pH恢复正常。

Dynabeads Protein A和G——结合率低

验证您的抗体与抗原的结合/特异性，例如通过ELISA检测。
检查您的抗体是否能够与磁珠结合。如果抗体没有被捕获并结合到磁珠上，免疫沉淀实验将无法进行。
如果您使用了间接法，尝试直接法。反之，如果您使用了直接法，尝试间接法。
检查磁珠的用量和样品体积。参考包装说明中不同磁珠的容量，在偶联过程中增加磁珠用量或提高抗体浓度。
延长孵育时间。
尝试更换另一种抗体。

Dynabeads Protein A 和 G——非特异性结合

使用更严格的洗涤缓冲液进行洗涤。
在洗涤缓冲液中添加非离子型去污剂（如Tween-20或Triton X-100），浓度范围为0.01-0.1%。
如果在沉淀前对磁珠进行了封闭，请在洗涤缓冲液中添加相同的封闭剂。
增加洗涤步骤的次数。
延长洗涤步骤的时间。
缩短孵育时间（磁珠和样品）。
尝试间接法。
降低抗体浓度。
可以进行预清除步骤，以去除那些非特异性结合到蛋白A/蛋白G或磁珠本身的分子。

Dynabeads与有机溶剂的兼容性

对于所有溶剂来说，两个重要因素是浓度和孵育时间。磁珠本身可与多种溶剂兼容，并且不会影响氧化铁沉淀：

与Dynabeads兼容的溶剂

乙醇（70%用于对磁珠进行灭菌/洗涤），
甲醇，
丙酮，
异丙醇，
二甘醚，
二甲基亚砜（DMSO），
二甲基甲酰胺（DMF）。
四氢呋喃（THF）与二甘醚类似，并且应该可以很好地与Dynabeads配合使用。
乙腈，
甲苯

共免疫沉淀（co-IP）

免疫共沉淀（Co-IP）是一种用于研究蛋白质-蛋白质相互作用的生化技术。它涉及使用针对目标蛋白的特异性抗体，从复杂混合物（如细胞裂解液）中分离该蛋白。蛋白质-蛋白质相互作用的研究通常涉及非常短暂且弱的相互作用，例如适配器蛋白与激活受体胞质尾部磷酸化酪氨酸残基的结合。或者，如果想检测所有与某一特定蛋白结合的分子，比如Praefke等人在2004年进行的一项非常有趣的研究，他们鉴定了适配器蛋白2（AP-2）、PIP2和网格蛋白（clathrin）的结合伙伴（Praefcke等，《EMBO Journal》VOL 23 | NO 22 | 2004）。

Albert等人的团队在2007年也进行了非常有趣的工作（Nature 450, 683-694），他们研究了核孔复合体及其相互作用，并随后进行了下游质谱分析。该团队使用了Dynabeads M-270 Epoxy与优化缓冲液组合，因为这些磁珠具有极低背景，可以避免制备过程中的污染。他们花费了大量时间寻找正确的缓冲液组成，以捕获这些弱相互作用。这些缓冲液是我们Dynabeads免疫共沉淀试剂盒的一部分，包含Dynabeads M-270 Epoxy磁珠以及抗体偶联缓冲液和共沉淀缓冲液。这些缓冲液为优化和微调不同蛋白之间短氨基酸序列之间弱而瞬时的相互作用提供了机会，可根据严格性进行调整。

可变成分以增加或减少Co-IP严格性的包括：

盐类
去垢剂
二硫苏糖醇（DTT）
蛋白酶抑制剂

缓冲液修饰剂

氯化钠（例如，1 M NaCl）
二硫苏糖醇（例如，1 M DTT）
氯化镁（例如，1 M MgCl2）
醋酸钾（例如，1 M KOAc）
Tween™-20
Triton X-100
无EDTA的蛋白酶抑制剂

如果已经优化了缓冲液，也可以购买Dynabeads抗体偶联试剂盒该试剂盒包含Dynabeads M-270环氧磁珠和抗体偶联缓冲液

关于抗体与磁珠的偶联，不建议大量偶联抗体（20-30微克抗体/毫克磁珠）。如果向磁珠中加入20微克抗体，最终共价结合到磁珠上的总抗体量不会超过13微克/毫克磁珠。在添加10微克以内时，添加的抗体与偶联的抗体之间呈线性关系。超过这个浓度后，抗体会沉淀到磁珠表面，但共价结合会减少。实际上，少于10微克的抗体可以确保高效的共价结合（无泄漏）和最佳功能。

阅读我们三篇博客系列中的其他内容，了解更多关于Invitrogen Dynabeads的信息：

仅供科研使用。不用于诊断程序。