qPCR耗材选购原则及异常案例分析

近几年，从科学研究到临床检测，从“非洲猪瘟”到“新冠病毒”检测，实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative PCR）已成为分子生物学研究的主要技术之一。除了高质量的检测试剂和稳定的qPCR仪器，实验耗材也影响结果的准确性和灵敏度，很多异常的结果就是由于耗材所导致。

因此，在实验开始之前，一定要确保耗材符合要求。实验中，要正确使用耗材，才能达到事半功倍的效果。本文将给大家介绍一些耗材选择的要点以及使用注意事项，并结合几个案例，带着大家一起看一下常见的由于耗材问题而导致的异常结果。

在选购qPCR耗材的时候，需要注意以下几个要点：

1耗材的纯度

qPCR耗材通常直接接触试剂和样本，要求表面不易附着生物分子，不干扰荧光信号。同时，它要具有优异的化学耐受性和温度耐受性，能承受热循环过程中的温度波动。此外，对于密封膜和管盖，要求其具有光学透明或超透明的特性，以减少荧光信号的失真，保证数据的准确性。

2耗材的洁净度

qPCR耗材必须没有污染物，防止灰尘、核酸酶或DNA残留物存在，这些物质不仅影响反应的扩增，还影响信号采集。因此，耗材生产以及保存必须在严格且洁净的环境中。

3耗材的材质

确保所选择的耗材在反应中具有最佳热传导的特性。当然，耗材的壁厚和硬度直接影响实验，如果管壁太薄，容易在操作中发生破裂；还有一些硬度不够的管子，在加热循环过程中管子变形，导致管盖弹开，密封性降低，出现蒸发现象，并污染仪器。

4耗材的密封性

优质的耗材是有防蒸发保护设计的，确保反应孔和膜或者管盖之间的密封性，来减少交叉污染以及反应体系在实验过程中蒸发。除了产品本身，封膜的操作过程也很重要，务必确保膜或管盖封好，以免影响实验结果。

5耗材的规格

选择已验证，且与所使用的qPCR仪兼容的耗材，以确保最佳的适配性和性能。适配耗材都有严格的尺寸要求，耗材尺寸上的一些小的偏差不仅影响结果，还会导致仪器运行报错，影响仪器寿命。

耗材选择固然重要，但操作使用同样也至关重要。正确的操作和使用方法可以确保实验结果的准确性和可靠性。以下是一些关键点：

01 实验前，确保耗材是与仪器的加热模块适配的，如果是96-well 0.2mL的加热模块，一定要使用96-well 0.2 mL的耗材，如果错误使用了96-well 0.1 mL的耗材，虽然仪器可以正常运行，但是由于0.1 mL的耗材与0.2 mL的加热模块贴合不紧密，温度传输及控制不准确，最终会导致扩增异常、重复性差等现象。

02 实验中，一定不要在8连管的管盖、管壁或者反应板的膜上做任何标记，这些标记在热循环过程中会影响信号采集，还会污染加热模块，导致结果异常。此外，配置体系的时候，反应板或8连管应放置在base上面，防止操作台或离心机等台面的污染物黏附在管底，污染加热模块。

03 上机时，要注意正确使用对应的配件，例如7500仪器配套的8连管的托架是黑色且四周带有海绵的，如果错误使用反应板的不带有海绵的托架，将会导致结果异常。此外，在使用8连管进行实验时，若样本较少，要确保8连管放置在加热模块中间，左右两列放置空管作为平衡支撑，保证热盖工作时受力均匀。

若您使用的是Applied Biosystem系列的qPCR仪器，可参考公众号之前的一篇文章《贴士：正确使用荧光定量仪器配件和耗材（更新版本）》进行耗材的选购和使用。

接下来，和大家分享几个比较典型的实验耗材导致结果异常的案例，这些都是平时qPCR实验中遇到的，供大家参考。

案例一

第三方耗材导致报告基团信号在基线期信号下降，导致曲线形态异常。Applied Biosystem的qPCR仪器是开放且兼容性强的平台，客户可以根据自己的需求使用第三方的试剂和耗材。但是，目前市面上第三方耗材品牌繁多，质量良莠不齐，批次差异大，影响实验结果，延误项目等。所以，大家在选择耗材的时候，务必要选择品质卓越，规格匹配的产品，从而保证实验结果的准确。下图案例就是一个使用质量不好耗材导致信号异常的案例，FAM和ROX信号在基线期逐渐下降（图一左），通过测试排查，推测客户使用的耗材中某种组分引起信号下降，更换官方耗材后信号正常（图一右）。

图一：质量不好耗材导致荧光信号不稳定(左)以及更换官配耗材后的结果(右)

案例二

对于qPCR耗材来说，生产、包装、运输和使用过程中，有可能会接触到灰尘、纤维或其他微小颗粒，会导致杂质进入反应孔，最终影响实验。图二案例中，客户发现其中一个孔信号异常（图二左），查看反应板发现，反应孔中有一个黑色的杂质，可能是管子本身或者操作过程中带入。后续换用干净qPCR耗材重新实验，结果正常（图二右）。图三案例中，固定孔曲线异常（图三左），排查发现是加热模块污染，客户实验的时候没有用base的习惯，直接放置在实验台上，可能是粘附了一些污染物，污染了加热模块。清洗过后重新实验，结果正常（图三右）。

图二：管中杂质导致信号异常的结果(左)以及更换干净耗材后的正常结果(右)

图三：加热模块被污染导致曲线异常(左)以及模块清洁后曲线正常(右)

案例三

qPCR反应体系是密封的，所以要确保反应孔和膜或者管盖之间的密封性以减少交叉污染。有些厂家为了降低成本，生产的耗材硬度低，管子容易变形。图四案例中，客户使用的反应管在加热循环过程中变形，管盖弹开密封性降低，产物蒸发污染仪器。图六案例中，客户的膜没封好，在反应中发生“optical warping”（图五），导致溶解曲线出现多个峰（图六左）；换膜重新封好膜后，再一次运行溶解曲线，结果正常（图六右）。

图四：国产八连管管盖弹开体系蒸发导致曲线异常(左)以及换用官方耗材后曲线正常(右)

图五：膜没封好，导致反应过程中的水蒸气使膜变形

图六：客户膜没封好导致溶解曲线异常(左)以及重新封膜后的正常溶解曲线图(右)

案例四

qPCR耗材的规格一定要适配qPCR仪器，以保证实验性能。有一些第三方的耗材与官方耗材在尺寸上有一些小的偏差，长时间使用，不仅影响结果，还会影响仪器寿命。图七案例中，客户长时间使用第三方耗材，其略高于官方耗材，长时间使用，导致仪器运行报错（图七），热盖无法复位。此外，客户还经常在实验中混用实验室耗材，特别是实验室有不同型号仪器的客户，实验中一定要注意选择适配的耗材。有客户长错误将0.2 mL的反应板用在0.1 mL模块的仪器上，导致仪器报错（图七所示），热盖无法复位。图八案例中，客户错误将0.1 mL的反应板用在0.2 mL模块的仪器上实验，导致孔和加热模块贴合度不好，部分孔扩增受到影响，导致内标都没有扩增（图八左），更换0.1 mL的反应板后结果正常（图八右）。