什么是数字Digital PCR？——了解dPCR的优势

数字PCR是一种专门用于核酸检测和定量的方法，通过统计学方法估算分子的绝对数量。数字PCR（dPCR）使用与qPCR相同的基本化学反应，但与qPCR数据不同，dPCR的数据是在反应混合物终点时收集的。在扩增之前，由核酸、引物、探针和主混合液组成的大体积PCR反应会被分割成成千上万个纳升级微反应体系。由于这种数字化过程将PCR混合液分配到如此多的微反应中，每个微反应实际上只会包含一个、零个或少量目标核酸分子。随后将这些隔离的微反应进行扩增，并在热循环结束后从每个微反应中收集数据。不含目标分子的微反应在扩增后不会显示荧光，而含有目标分子的则会显示扩增后的荧光信号。

实际上，原始反应被转变为许多二元（有/无）反应。在统计阳性微反应数后，可以利用简单的统计方法直接确定目标分子的“绝对”数量，而无需通过与已知浓度标准品比较来估算。这项技术为绝对定量和稀有等位基因检测提供了qPCR之外的另一种选择，并且不依赖于扩增循环数来判断每个样本初始模板核酸的含量。

迄今为止，qPCR一直是一种功能强大且灵敏的基因分析技术，被广泛应用于各种领域。正如其名称所示，qPCR是在扩增过程中实时测量PCR产物，而传统PCR则是在整个反应完成后才收集结果，因此无法确定起始核酸浓度。qPCR进入市场彻底改变了基于PCR的DNA和RNA定量方式。

数字 PCR vs. 实时荧光定量 PCR vs. 传统 PCR

迄今为止，qPCR已成为一种强大且灵敏的基因分析技术，被广泛应用于各种领域。顾名思义，qPCR能够实时监测PCR扩增过程，而传统PCR则是在反应结束后收集结果，因此无法确定核酸的起始浓度。qPCR进入市场后，彻底改变了基于PCR的DNA和RNA定量方法。

数字PCR是一种较新的核酸检测与定量方法，通过统计学方法估算分子绝对数量。这项技术为绝对定量和稀有等位基因检测提供了qPCR之外的替代方案，不再依赖扩增循环次数来判断每个样品中模板核酸的初始含量。

数字PCR vs. 实时荧光定量PCR（qPCR） vs. 传统PCR对比一览
	数字PCR	实时荧光定量PCR（qPCR）	传统聚合酶链式反应（PCR）
概述	通过测量阴性微反应比例来确定绝对拷贝数。	在整体反应混合物中实时监测PCR扩增过程。	在PCR循环结束时测量累积的产物数量。
定量吗？	是的——阴性微反应的比例通过泊松统计算法进行拟合。	是的——数据是在PCR指数增长阶段收集，此时PCR产物的数量与模板核酸的数量成正比。	不是——但是，将凝胶上扩增条带的强度与已知浓度的标准进行比较，可以获得半定量结果。
应用领域	病毒载量的绝对定量 核酸标准品的绝对定量 下一代测序文库的绝对定量 稀有等位基因检测 基因表达的绝对定量 单分子多重分析多个目标	基因表达定量 微阵列验证 质量控制与检测方法验证 病原体检测 SNP基因分型 拷贝数变异分析 微RNA分析 病毒定量分析 siRNA/RNAi实验	DNA扩增用于： 测序 基因分型 克隆
优势	无需依赖参考物或标准品 通过增加PCR重复次数可实现所需精度 对某些PCR抑制剂更具耐受性 能够分析复杂混合物 对存在的拷贝数提供线性响应，可检测微小倍数变化	检测的动态范围增加 无需PCR后处理 可检测最低至2倍变化 在PCR指数增长阶段收集数据 报告荧光信号的增加与扩增产物数量成正比 被切割的探针为扩增产物提供了永久记录	设计简单 操作容易 使用更易获得的设备和试剂 无需特殊培训

数字PCR的工作原理

dPCR通过计数单个分子实现绝对定量

传统PCR在反应平台期进行测量，由于反应动力学的变化导致结果不稳定；而qPCR在指数期进行测量，能够更准确地定量。dPCR则通过计数单个分子，实现绝对定量。

dPCR与单个微反应的重要性

dPCR通过将DNA、cDNA或RNA样本分成许多个独立的微反应来工作；有些微反应中含有一个或多个分子，而有些则没有。每个微反应分别进行PCR扩增和分析。含有扩增产物和不含扩增产物的微反应会被分别计数。含有扩增产物的被判定为阳性；不含扩增产物的被判定为阴性。

微流控板可并行运行数千个微反应

微流控板提供了一种方便且直接的方法，可以并行运行数千个微反应。板上的每一个上游孔都被加载了样本、主混合液和试剂的混合物，在分配到各个微反应后，分别分析以检测终点信号的存在与否。

在PCR分析之后，阴性微反应的比例用于生成样品中目标分子的绝对数量，无需标准品或内源性对照。

校正因子用于确定模板的绝对数量

泊松模型

由于随机分配，无法保证每个阳性反应只接收到一个分子。为了校正可能接收到多个目标序列分子的微反应，需要使用泊松模型应用修正因子来确定绝对模板数量。

在以下情况下：Applied Biosystems™ QuantStudio™ Absolute Q™ 数字PCR系统，每个Applied Biosystems™ QuantStudio MAP16 dPCR 反应板包含20,480个固定微腔。完成dPCR反应后，QuantStudio Absolute Q 数字PCR分析软件会设定阈值并进行计算。

使用泊松模型

要应用泊松模型，必须至少有一个阴性反应——即没有分子的反应。泊松模型描述了一个反应获得零、一个、两个或三个拷贝的概率（见上方柱状图）。该模型对含有多个分子的反应进行校正，并提供结果正确的概率。因此，样本数字化结合泊松统计数据分析，比传统的PCR和qPCR方法具有更高的精确度。

在使用泊松模型时，需要注意的是，阴性反应最为重要（见上方96孔板结果）。它们不仅帮助确定原始样品中DNA分子的数量，还能建立PCR分析后阳性与阴性反应的比例。

例如，数字PCR特别适用于需要检测少量输入核酸或对样品中目标数量进行更精细分辨的应用，例如癌症研究中，在液体活检样品中检测极低含量的癌症突变稀有序列。

相关内容: Mutation Detection Using Digital PCR

标题：对于任何数字PCR反应，当每个反应含有1.6个拷贝时可获得最大精确度。图表显示了每个样品采用20K（绿色）、12K（蓝色）或3K（红色）微反应所能达到的精确度。X轴代表阴性反应（20.32%），Y轴代表精确度（95%置信区间）。最大精确度对应于20%阴性和80%阳性反应。从绿色线来看，20K微反应/样品时，精确度在约5%到90%的阴性反应之间保持一致。为了增加每个样品的微反应数，可以通过数字汇聚提升精确度。这是调整样品浓度时要追求的目标，例如，每孔一个拷贝——15微升内进行20,000次反应。在两端极值情况下，精确度会急剧下降。

数字PCR实现高水平准确性和重复性

在讨论应用之前，这里有一组数据展示了数字PCR的重复性。

下图展示了dPCR在绝对定量方面的重复性。该图显示了一项绝对定量实验在24块板、3位不同用户之间运行的结果。如图所示，这三位不同用户基本上都获得了相同的结果。

数字PCR适用于多种应用

dPCR非常适合进行稀有等位基因检测、拷贝数变异测量、病毒滴度测量、下一代测序文库定量，以及从环境样本（如废水）中检测稀有目标。

绝对定量的具体应用包括：

• 拷贝数变异（CNV） – 以高度精确性检测和定量小比例的拷贝数差异
• 下一代测序（NGS）文库定量 – 对NGS文库进行绝对定量并验证测序结果，无需参考标准品
• 稀有目标定量 – 检测和定量癌症研究样本中低流行率目标的稀有突变
• 病毒滴度定量 – 对细胞和基因治疗研究中常用的病毒载体骨架，如腺相关病毒（AAV）和巨细胞病毒（CMV），进行绝对定量
• 环境病原体检测 – 从环境样本如废水或污水样本中检测致病病毒和细菌

dPCR优势总结

dPCR提供绝对定量机制

首先，dPCR提供了一种绝对定量的机制，让您无需标准曲线即可确定样品中的分子数量。这对于参考实验室和基因表达分析尤其有益。

dPCR可识别稀有分子

其次，dPCR能够在大量正常等位基因中识别稀有分子，例如在循环游离DNA中检测致癌突变。

dPCR对抑制剂敏感性较低

最后，由于dPCR是终点PCR反应，它对抑制剂的敏感性比qPCR反应低。在qPCR反应中，像SDS或肝素这样的抑制剂可能会影响PCR效率。这一特性对于处理环境样本或珍贵癌症样本的研究实验室来说非常重要。

了解更多关于数字PCR的信息

• 下载数字PCR技术文献
• 比较与对比数字PCR vs. qPCR vs. 传统PCR – 三代PCR技术。
• 获取信息关于QuantStudio Absolute Q数字PCR系统 – 了解这一功能强大且简单的数字PCR系统。该单一仪器系统拥有类似qPCR的简便工作流程，90分钟快速出结果，并且无需参考曲线即可进行定量分析，在没有标准曲线的情况下以拷贝数/μL提供浓度测量。
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