14个成功RNA提取注意事项

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即使是经验最丰富的分子生物学家，也曾在RNA提取过程中忍不住爆出自己最爱的脏话。在非科学家看来，这可怜的人似乎快要崩溃了，对着装着无色、无特征液体的无辜试管大吼大叫。

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但对于那些亲身体验过RNA提取种种烦恼的科学家来说，很容易产生共鸣。愤怒情绪的爆发（也被称为“RNAnger”）是与RNA打交道时自然且常见的副作用。这也完全可以理解：提取产量低和RNA降解这类问题，连资深科学家都可能遇到。

获得高质量特定样本类型的RNA已成为许多实验方案中的基础环节，包括新一代测序（NGS）、定量实时PCR（qRT-PCR）、Northern blotting 和cDNA合成等，很多科研人员都会定期进行此类操作。低质量的RNA会严重影响下游分析，导致时间和金钱的浪费。

但事情本不必如此。许多RNA提取的问题是可以避免并克服的。为了帮助你在RNA提取的道路上取得胜利，我们准备了14个技巧，助你将“RNAnger”转化为“RNAccumen”。

选择合适的RNA提取试剂盒

市面上有许多用于RNA提取的试剂盒和试剂。但某些实验方案或格式可能更适合你的目标。请对每个RNA提取试剂盒或者试剂进行仔细的研究 ，并考虑你要从中提取RNA的样品类型、起始样品量、下游分析方法、所需的通量以及你要分析的RNA类型。理解不同试剂盒的RNA提取步骤及原理有助于做出明智选择。

例如，如果你需要一种用于总RNA的高通量纯化方法，那么你可能要考虑可扩展的MagMAX™试剂盒而不是 TRIzol RNA提取法。但如果你的样品数量较少，并希望使用高质量RNA的黄金标准方法，那么你每次都会选择TRIzol。

注意起始量

多并不总是更好。大多数RNA分离试剂盒RNA分离试剂盒和试剂都为特定类型的样品提供了推荐的起始材料数量。添加超过推荐的数量可能会抑制有效的细胞裂解或RNA与其他细胞成分的分离。对于基于离心柱的方法来说，你可能会超出离心柱的结合容量，从而降低整体得率。

请注意，不同动物组织中的RNA含量可能会有很大差异：心脏和肌肉细胞的总体RNA含量比脾脏和胸腺细胞少，而脾脏和胸腺细胞通常富含核酸。这些组织也可能引入额外的干扰因素这可能会使提取变得复杂，并且可能需要对实验方案进行修改，以提取高质量的RNA。

创建无RNase（RNA酶）的环境

RNases？从没听说过吧？

它们是你RNA提取过程中的头号敌人。它们很难被灭活或清除。RNase A家族中的RNA酶由多个二硫键稳定，即使 在变性后 1,2仍能保持活性。为了减少在RNA提取过程中意外引入RNases，请创建一个无RNA酶的洁净操作台区域。该区域可以是你实验台的一部分，用胶带标记出来，与进行DNA或蛋白质提取的区域分开。将专用于RNA提取工作的试剂、耗材、移液器和手套放置并保存在此区域内。

穿戴个人防护装备（PPE）

你是RNase的主要来源。你的汗水和皮肤油脂都是RNase污染的丰富来源。3,4 因此，戴手套以防止手部污染至关重要。如果你碰巧用戴着的手套接触了可能带有RNase的表面（例如门把手、你的脸部或上述无RNase区域外的其他表面），请务必更换手套。你还可以穿上实验服，以确保身体其他部位的皮肤不会接触到样品。

使用无RNase的试剂和耗材

与上述观点一致，你还可以购买清洁产品、耗材和其他试剂，以帮助远离RNase，确保它们不会接近你的RNA。表面去污染溶液可以帮助从玻璃器皿、实验台面和移液器上清除RNase。

你可能会认为所有离心管和移液枪头在出厂时都是无RNase的，但许多产品可能在生产过程中引入了RNase。请确保你的耗材被认证为无RNase，并且使用滤芯吸头以防止来自移液器尖端的污染或样本间的交叉污染。

RNaseZap和实验室清洁剂有助于保持实验室无RNase环境

进行预实验

开始RNA提取前，你可能没有意识到某个潜在步骤会使你的RNA暴露于RNase污染之下，或者直到开始实验后才发现你计划使用的试剂盒并不适合你的样本类型。为了避免浪费您宝贵的样品，请先使用价值较低的样品进行小规模试验，以便在您的RNA提取方案中解决问题。这样可以节省因返工带来的高昂成本，或避免重新收集样本的情况。

稳定您的RNA

RNA的生化特性使其本质上不稳定，并且某些RNA具有较短的半衰期。为了确保不会影响到下游分析结果，您应在采集样本后尽快破坏所有内源性RNA酶。您可以通过使用 TRIzol 或我们提供的裂解缓冲液裂解细胞来实现这一目标。PureLink™ RNA Mini 试剂盒以及将样品在-80°C下冷冻保存以备后续处理。您也可以在裂解缓冲液中重悬后立即提取RNA。或者，在液氮中速冻样品可以防止样品收集后的RNA降解。

如果您不想处理液氮带来的困难，可以使用RNA稳定试剂，例如RNAlater。它能立即灭活RNase，让您灵活选择有时间时再提取RNA，而不必担心RNA降解。

RNA提取产品

增加机械或酶促裂解步骤

石蜡包埋（FFPE）样品、血液样品以及某些微生物素来难以提取到足量高质量RNA，可能需要额外步骤确保完全裂解。这些步骤可包括使用珠击法进行机械裂解，或使用溶菌酶或蛋白酶K进行酶促预处理。如前所述，裂解不完全可能会导致基于离心柱的提取方法出现下游问题。从难处理的样品中提取RNA之前，请仔细查看实验方案，确认是否包含针对此类样品的具体操作步骤。

保持低温环境

RNA的不稳定性使得在整个处理过程中保持样本低温至关重要。如果你之前遇到过RNase的问题，可以考虑将提取溶液保持低温、在低温室中进行提取，或者使用预冷的离心机进行离心步骤。

去除DNA污染

大多数RNA提取试剂盒和试剂都能有效去除污染性的基因组DNA或质粒DNA。但某些下游定量方法，例如NanoDrop，或者应用如qRT-PCR，能够检测到即使微量的DNA并影响分析结果。

为了解决这个问题，许多基于柱子的纯化方法都包含DNase I，比如PureLink™ DNase Set，可用于柱上处理。你也可以在提取后使用DNase I进行消化处理。

定量RNA并进行质量控制

有几种方法可以对纯化的RNA进行质量控制并获得准确的定量结果。你可以使用260nm波长（用于核酸）、280nm波长（用于蛋白质污染）以及230nm波长（用于其他污染物，如硫氰酸胍）的紫外吸收值进行测定。RNA纯度可以通过A260/A280比值（目标范围为1.8至2.2之间）和A260/A230比值（目标值>1.7）来估计。

荧光计，例如 Qubit 荧光计， 也可以定量 RNA，且比基于紫外吸收的方法更灵敏。基于微流控的技术也有助于RNA的定量和质量评估。样品用荧光染料标记后通过凝胶基质进行电泳。不同的RNA种类根据其大小在基质中迁移，通过观察完整的荧光轨迹可以评估RNA的完整性。该方法可检测DNA污染物或RNA降解产物，并将其结果转化为1到10分的RNA完整性数值（RIN），其中10分表示RNA完整性最佳。

储存纯化的RNA

 许多基于离心柱或磁珠的试剂盒都提供无RNase的洗脱缓冲液，能够长期保护RNA的完整性。对于TRIzol RNA提取法，您可以将干燥的RNA沉淀重新溶解于无RNase的水或其他专用储存溶液中。定量后，将RNA分装至单次使用管中，以尽量减少冻融循环（可能导致降解）或意外RNase污染。如果计划短期内使用RNA，请将其储存在-20°C；如需长期保存，则应储存在-80°C。

自动化RNA提取

 多种可用的RNA提取试剂盒（包括前面提到的MagMAX试剂盒）均可与自动化提取和纯化系统配合使用，例如 KingFisher™。自动化有助于避免RNA提取过程中的一个主要问题——来自人为接触的RNase污染。此外，它还能实现可重复的RNA纯化，并相比手动样品制备方式减少75%的操作时间。

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寻求帮助

有些问题过于复杂，无法自行解决。如果您需要有关RNA提取的额外支持和帮助，请访问我们的RNA样本采集、保护与分离支持中心。我们提供指南、基础教程、故障排除技巧、培训以及更多资源，帮助您顺利进行RNA提取。

如需继续学习，我们还提供了更多的在线资源：

本文仅供科研使用，不可用于诊断程序。

参考文献

  1. 与RNA共事：基础篇。
  2. Klink TA, Woycechowsky KJ, Taylor KM, Raines RT。二硫键对核糖核酸酶A构象稳定性和催化活性的贡献。《欧洲生物化学杂志》。2000;267:566-572。
  3. Gupta SK, Haigh BJ, Griffin FJ, Wheeler TT。哺乳动物分泌的核糖核酸酶：在宿主防御中的作用机制。《先天免疫》。2013;19:86-97。
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  5. RNA。EMBL-EBI网站：https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/biomacromolecular-structures/rna/。
  6. Sharova LV, Sharov AA, Nedorezov T, Piao Y, Shaik N, Ko MS. 通过DNA微阵列分析多能性和分化中的小鼠胚胎干细胞获得的19977个基因mRNA半衰期数据库。DNA Res. 2009