利用TaqMan技术的microRNA图谱分析服务

特点：

  • 一天内得到结果 — 在低至5小时的时间内完成数百个miRNA的图谱分析实验 。
  • 是人、小鼠和大鼠的图谱分析理想的工具。
  • 只需要极少量的样品 — 低至1 ng的总RNA—适合FFPE、FACS、活检和其他极少量的样品 。
  • 已知miRNA的全面覆盖，与Sanger miRBase v14一致
  • 消减cDNA文库 — 应用抑制PCR原理，分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。

 MicroRNA 芯片TaqMan MicroRNA Array的流程
获得结果的时间至少2天；第一天标记样品，准备杂交；第二天洗涤和扫描芯片一天，两步（如果包括预扩增就是三步），从总RNA到实时定量PCR数据
动态范围一般2-3个对数（某些平台在应用某些探针时能达到4个对数）多达7个对数，在单个实验中实现高表达和低表达miRNA的同时检测
特异性

考虑到芯片测定依赖单个杂交事件，交叉杂交是个问题。

捕获探针的杂交不能区分miRNA前体和有生物活性的成熟miRNA。

TaqMan试剂实现了高特异性—信号扩增需要4个独特寡核苷酸的杂交

使用新颖的茎环结构反转录引物，具有检测生物学活性成熟miRNA的特异性
起始RNA量一般为1 μg以上（某些平台支持100 ng）介于1-1000 ng
已知miRNA的覆盖度芯片设计一般只依赖硅片选择和捕获探针的设计，而没有任何的实际平台验证。这会因非灵敏探针而导致覆盖度降低。此外，介于杂交技术的灵敏度有限，低表达miRNA不大能检测到。高度成功且经过验证的硅片设计管道中的所有分析都经过了实际平台验证，才用于Megaplex Primer Pools和TaqMan Arrays。联同Megaplex Primer Pools的分析性能经过了再次验证。因此，包含的所有分析都认为能提供信息。


原理：

利用Megaplex™ RT Primers（miRNA特异的茎环结构引物的混合物），在单个反应中最多反转录381个miRNA。接下来是可选的扩增步骤，利用Megaplex™ PreAmp Primers来进行。这个无偏向性的扩增步骤显著增加了样品中miRNA的浓度，为实时定量PCR带来了最大的灵敏度和检测。在最后的定量步骤中，TaqMan Universal PCR Master Mix加入到每个样品中，混合物移至TaqMan Array的上样口，TaqMan Array是一种预装的微流体卡片，内含384个TaqMan MicroRNA Assay。最后在Applied Biosystems 7900HT 快速实时定量PCR系统上运行实时定量PCR。

服务流程：

1、收到样品后提取RNA或miRNA，并进行样品QC
2、用MegaplexTM RT Primers进行反转录
3、根据需要利用MegaplexTM PreAmp Primers扩增cDNA
4、逆转录产物上样到Taqman MicroRNA Array
5、在7900HT快速实时荧光定量PCR系统上进行荧光定量PCR
6、数据分析

客户提供：

液氮速冻或者保存在RNAlater 中的组织，细胞或穿刺样品等类型的样品。

我们提供：

microRNA 图谱数据分析报告，包括扩增曲线，Ct值。

质量保证：

1、高质量的定量数据—对microRNA 表达量的分析线性范围在6个数量级以上
2、高敏感度—可以检测最低1-10ng 总RNA中的microRNA
3、高特异性—仅检测成熟的microRNA，不受microRNA前体的干扰