ELISA与Western Blot实验的区别：何时使用哪一种免疫测定技术-赛默飞

ELISA与 Western Blot实验的区别：何时使用哪一种免疫测定技术

ELISA 是一种高度灵敏、特异性强且用途广泛的技术，能够检测复杂生物样本中低至纳摩尔浓度的蛋白质。它相对容易操作，并且可以同时分析多个样本。然而，与蛋白质印迹法相比，ELISA 更容易出现假阳性或假阴性结果，也无法提供关于目标蛋白的全面信息。

另一方面，虽然蛋白质印迹技术（Western Blot）可能具有更复杂的操作流程，但它通常能提供清晰且易于解读的结果。它经常被用作对ELISA及其他检测方法所得结果的确认工具。

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什么是ELISA（酶联免疫吸附测定）？

酶联免疫吸附测定或ELISA是一种高灵敏度和特异性的酶免疫分析技术，用于对抗体或抗原进行定性和定量分析，包括蛋白质、激素、肽类、核酸等。

ELISA实验是在96孔聚苯乙烯吸附板上进行的。这些微孔板能够使抗体或抗原附着，并允许在同一次实验中筛选多个样本。

ELISA的实验过程通常遵循四个基本步骤：使用抗体或抗原包被微孔板，用牛血清白蛋白（BSA）或其他分子进行封闭，通过加入显色底物进行检测，最后读取结果。

ELISA 试剂盒和 ELISA DIY

ELISA有四种主要类型包括

直接ELISA：这里使用包被抗原的板来检测抗体。
间接ELISA：这种类型使用包被抗原的板来筛选抗原或抗体。
夹心ELISA：它使用包被抗体的板来筛选抗原。抗原被夹在捕获抗体和检测抗体之间，因此得名。
竞争ELISA：该检测用于检测针对待测血清中抗原特异性的抗体。

常见ELISA格式示意图（直接法与夹心法）

常见ELISA格式示意图（直接法与夹心法）。在该检测中，通过将目标抗原直接吸附到检测板上，或者首先将捕获抗体固定在板表面，从而实现抗原的固定。随后可以使用酶标记的一抗（直接检测）或配套的未标记一抗和标记二抗（间接检测）来对抗原进行检测。

ELISA的优缺点

这是一种高效省时的方法，用于确定样本中是否存在蛋白质。
其操作过程简单快捷，所需的样本准备较少。
它是一种灵敏度更高的免疫测定方法，能够检测样本中的单一蛋白质或低浓度蛋白质。
它可以同时进行多项分析。
它使用成本较低的试剂，使其适用于要求较高的预算，特别是对于可以选择未包被ELISA试剂盒的有经验用户。
其特异性有限，由于技术错误、样本污染、低质量试剂的使用等原因，更可能出现假阳性或假阴性结果。
ELISA试剂盒中的抗体必须运输和储存在冰箱中，因为它们容易失稳。
不能依赖它生成关于目标蛋白的其他信息，例如其分子量和丰度。

什么是Western blot？

蛋白质印迹法也称为免疫印迹，是一种用于检测和定量目标蛋白（包括复杂混合物中低水平蛋白质）的常规技术。它是一种有价值的检测方法，可用于识别和理解蛋白质表征，蛋白质互作，蛋白质修饰等。

蛋白质印迹（Western blot）首先通过凝胶电泳根据分子量将混合物中的蛋白质分离出来。然后将分离的蛋白质从凝胶中转移到蛋白结合膜上并与其结合。最后，用针对目标蛋白质的抗体用针对目标蛋白质的抗体对膜对膜进行孵育，从而在膜表面检测该蛋白质。

使用iBright成像系统捕获的荧光蛋白质印迹图像示例

使用iBright成像系统捕获的荧光蛋白质印迹图像示例。

蛋白质印迹的优缺点

如果操作得当，它可以提供精确且易于解释的结果。
它具有高度特异性，能够从成千上万种蛋白中识别出目标蛋白
它通常最适合作为确认性工具而非完全定量工具使用。
这可能是一个成本较高且耗时的过程。
除非使用长时程底物（8–24小时）或荧光染料，否则检测信号会迅速衰减。
它对样本制备中的杂质更为敏感，容易产生高背景或其他检测困难。

ELISA 和蛋白质印迹（Western Blot）是检测和分析蛋白质的两种常用方法。虽然 ELISA 是一种出色的蛋白质检测和定量工具，但 Western Blot 通常用于验证 ELISA 的结果，因为它更可能提供明确的结果。此外，Western Blot 还能从复杂的混合物中获取有关目标蛋白的大量信息，包括其大小和含量，而不仅仅是像 ELISA 那样给出一个阳性或阴性的判断。

以下是何时使用每种蛋白质检测和定量技术的指南：

何时使用ELISA进行蛋白质分析

作为最灵敏的免疫测定方法，ELISA具有高灵敏度，可用于检测少量的目标蛋白、稀有蛋白以及低丰度蛋白。当你需要精确量化蛋白质浓度时，ELISA是更好的选择。而Western blot只能测量蛋白质的相对丰度，无法测定其绝对浓度。

速度也是选择ELISA而非Western blot的另一个原因。ELISA的实验步骤更快且样品前处理要求较低，适合常规检测。与Western blot不同，ELISA使用的微孔板和读数仪可以快速分析样本。

此外，ELISA流程也更加简便。它使用的样品体积更小，采用标准的96孔板，并支持多重检测。同时，ELISA还可以实现自动化操作，减少人为误差和重复性手工操作。如果你需要高通量或自动化的实验室设置，这种流程将是理想选择。此外，对于初级科研人员来说，ELISA比Western blot更容易教学，因为后者更为复杂，涉及凝胶分离、膜转移、成像等多个步骤。

另外，如果你只需要知道蛋白质是否存在，或者可能检查其浓度，那么ELISA已经足够。

何时使用Western blot进行蛋白质分析

Western blot最适合从复杂的混合物或样品中检测多种蛋白质。另一个使用Western blot的关键原因是其在测量蛋白质时具有高度特异性，即使在相对较低水平下也能检测到目标蛋白。

假设您需要了解更多有关蛋白质的信息，例如其分子量、纯度、蛋白质相互作用、蛋白质表达变化或翻译后修饰的详细信息。在这种情况下，蛋白质印迹（Western blot）可以是一个强有力的工具。

如果您确信所用结合抗体具有特异性，并且能够检测非靶标蛋白，则蛋白质印迹也是一个极佳的选择。特别是荧光蛋白质印迹检测技术，支持多重检测，可在一次实验中同时检测多种蛋白质。

最后，蛋白质印迹通常被用作许多互补性蛋白质分析方法（如ELISA或质谱）的确认工具,尤其是在临床医学诊断环境中，因其能够有效排除假阳性或假阴性.

参考文献

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仅供研究使用，不可用于诊断程序。

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