基于 EVOS M7000 的细胞活力自动荧光成像与定量分析解决方案

引言

细胞活力是评价药物细胞毒性、感染进程及多种疾病模型中细胞健康状况的重要指标。传统细胞活力或毒性检测多依赖比色法或发光法等整体信号读数，虽然适合高通量筛选，但难以在单细胞水平获得活细胞与死细胞的空间分布与形态信息，且图像获取和分析通常费时费力。

 

随着自动化荧光成像系统及配套图像分析软件的发展，利用荧光成像直接定量活细胞和死细胞比例已变得更加高效可行。本文基于 Thermo Fisher Scientific 的 Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Cell Imaging Kit (488/570)、NucBlue™ Live ReadyProbes™ Reagent、EVOS™ M7000 Imaging System 以及 Celleste™ Image Analysis Software，展示了一套从染色、自动成像到批量分析的完整细胞活力检测工作流程，以 A549 细胞经藤黄酸（gambogic acid）处理为示例。

 

说明：以下结构在保留原始技术要点的基础上进行了重组，以优化网站阅读体验。

应用背景

LIVE/DEAD Cell Imaging Kit 的原理

Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Cell Imaging Kit (488/570) 通过两种荧光探针实现对活细胞与死细胞的区分：

  • 活细胞检测组分（Live Green，calcein AM）
    • 细胞可渗透，在具有细胞内酯酶活性的活细胞中被酶切，产生强、均一的绿色荧光。
    • 激发/发射波长约 488/515 nm，适配常用 GFP 通道。
  • 死细胞检测组分（Dead Red）
    • 细胞不可渗透，仅可进入细胞膜受损的死亡或濒死细胞，与核酸结合后产生红色核荧光。
    • 激发/发射波长约 570/602 nm，适配 Texas Red 通道。

通过同时检测细胞内酯酶活性与细胞膜完整性，该试剂盒可灵敏区分活细胞与死细胞，且染色步骤简便、适合批量样本处理。

 

EVOS M7000 自动荧光成像系统

EVOS™ M7000 Imaging System 是一款支持多通道荧光、明场等成像模式的全自动细胞成像平台，可兼容从覆盖玻片到 96 孔板等多种培养载体。其自动对焦、自动扫描和多位置成像功能，使用户能够在短时间内获得大量高质量荧光图像，非常适合执行活/死细胞检测、细胞毒性及药物筛选等实验。

 

Celleste 图像分析软件

Celleste™ Image Analysis Software 提供多种基于预配置算法的分析模板，其中 LIVE/DEAD 细胞分析模板可针对常见活/死细胞成像实验，快速完成目标分割与分类：

  • 通过 蓝色荧光（NucBlue/DAPI） 定义总细胞核数；
  • 通过 绿色荧光 定义活细胞；
  • 通过 红色荧光 定义死细胞；
  • 批量输出每个视野的活细胞计数、死细胞计数及比例，并可导出至 Microsoft™ Excel™ 进行剂量反应拟合等后续分析。

实验方法与结果

实验设计

  • 细胞类型：A549 肺腺癌细胞
  • 培养板规格：96 孔板
  • 接种密度：5,000 细胞/孔
  • 处理药物：藤黄酸（gambogic acid）
  • 处理浓度范围：0–40 µM
  • 每个处理条件的复孔数：4 孔
  • 总孔数：48 孔

细胞于 96 孔板中贴壁生长后，加入不同浓度的藤黄酸孵育过夜，以诱导不同程度的细胞毒性反应。

 

染色步骤与自动成像

  1. LIVE/DEAD 染色液配制
    • 解冻 LIVE/DEAD Cell Imaging Kit 组分后，将 1 mL 的 Live Green 溶液（组分 A，1 µM）转移至含有 Dead Red 冻干粉的试剂瓶（组分 B）。
    • 混匀后获得 2X 工作液。
  2. 细胞染色
    • 将 2X LIVE/DEAD 工作液等体积加入含细胞的培养基中。
    • 同时加入 NucBlue™ Live ReadyProbes™ 试剂，使用推荐剂量 2 滴/mL 培养基。
    • 室温（约 25°C）孵育 15 分钟。
  3. EVOS M7000 自动成像设置
    • 选择合适的放大倍数并设定对焦方式。
    • 使用 NucBlue 信号进行自动对焦，确保不同孔位间焦平面的一致性。
    • 设定 GFP 与 Texas Red 荧光通道的曝光与光强参数。
    • 建立自动采集程序：
      • 扫描 48 个孔位；
      • 每孔采集 4 个视野；
      • 使用三色荧光采集（蓝色、绿色、红色）。

最终共获取 576 张原始图像，并重叠整合为 192 个三通道荧光视野，为后续定量分析提供充足的数据基础。

 

图像分析流程（Celleste LIVE/DEAD 协议）

  1. 选择 LIVE/DEAD 分析模板
    • 在 Celleste 6 软件中调用预配置的 LIVE/DEAD 分析协议，加载通过 EVOS M7000 采集的三通道荧光图像。
  2. 目标分割与分类
    • 使用 蓝色荧光通道（NucBlue/DAPI） 进行智能分割，识别并计数总细胞核数。
    • 将 绿色荧光阳性细胞 定义为活细胞（具有酯酶活性且膜完整）。
    • 将 红色荧光阳性细胞 定义为死细胞或膜受损细胞。
  3. 结果导出
    • 所有视野的活细胞数、死细胞数及总细胞数自动写入数据表。
    • 软件同时计算每个处理条件下活细胞和死细胞的百分比。
    • 数据可一键导出为 Excel 文件用于进一步绘制剂量反应曲线等分析。

在本实验中，共计分析来自 48 孔、192 个视野的 超过 12,000 个细胞对象，确保结果具有较高的统计学可靠性。

 

结果：藤黄酸对 A549 细胞活力的剂量反应

  • 在 0 µM 藤黄酸 处理条件下，几乎 100% 细胞呈 Live Green 阳性，表明细胞活力良好。
  • 随着藤黄酸浓度由 0 提升至 40 µM，Live Green 阳性比例逐渐下降，而 Dead Red 阳性比例逐渐上升，显示明显的浓度依赖性细胞毒性。
  • 通过剂量反应拟合得到：
    • 藤黄酸对 A549 细胞的 EC₅₀ 为 4.9 µM；
    • 拟合曲线的 R² = 0.981，说明模型与实验数据高度吻合。

误差棒以标准误（SEM）表示，显示在多重复孔和大量细胞基础上，所得数据具有较小的变异度和良好的重现性。

应用场景

本自动化细胞活力成像和分析方案适用于多种研究场景，包括但不限于：

  • 小分子药物或生物制剂的 细胞毒性评估 与剂量反应研究
  • 抗肿瘤药物对 癌细胞株（如 A549） 的敏感性分析
  • 感染模型中，病原体或抗感染药物对宿主细胞活力的影响研究
  • 细胞工程、基因编辑后对细胞生长状态和存活率的评估
  • 高内涵成像（HCI/HCS）流程中活/死细胞参数的快速获取
  • 教学或实验平台上，作为 自动化荧光成像与图像分析培训案例

优势亮点

结合 LIVE/DEAD Cell Imaging Kit、EVOS M7000 与 Celleste 软件的整体解决方案具有以下突出优势：

  • 自动化高通量成像
    • 96 孔板 48 孔、每孔 4 视野，仅需约 13 分钟即可完成三色荧光采集，大幅提升实验效率。
  • 单细胞分辨率的定量结果
    • 直接基于图像进行活/死细胞计数，可同时观察细胞形态与空间分布。
  • 预配置分析模板，降低分析门槛
    • LIVE/DEAD 分析协议内置智能分割参数，用户只需少量调整即可快速完成批量分析。
  • 高统计学效力与数据可靠性
    • 单次实验即可分析超过 12,000 个细胞对象，获得拟合度高（R² = 0.981）的剂量反应曲线和稳定的 SEM。
  • 完整的一站式解决方案
    • 从染色试剂、成像硬件到分析软件均来自同一品牌，兼容性好、流程简洁，便于在实验室标准化推广。

小结

本文展示了利用 Invitrogen™ LIVE/DEAD™ Cell Imaging Kit、NucBlue™ Live ReadyProbes™ 试剂、EVOS™ M7000 自动荧光成像系统以及 Celleste™ 图像分析软件，对 A549 细胞在藤黄酸处理下的活力进行定量分析的完整流程。通过简单的染色步骤、自动化多孔板扫描及预配置的图像分析模板，研究者可以在较短时间内获取高质量的荧光图像和高可信度的细胞活力数据，包括活/死细胞比例和药物 EC₅₀ 等关键参数，为药物筛选和细胞毒性研究提供强有力的技术支撑。

 

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