六大关键组分

PCR的成功取决于一系列因素。其中,反应组分在扩增中起到至关重要的作用。以下列出了配制反应体系时,所需考虑的关键因素:

模板DNA

用于复制的PCR模板可以是任何DNA来源,如基因组DNA(gDNA)、互补DNA(cDNA)和质粒DNA。不过,DNA的组成或复杂度会影响PCR扩增的最佳起始量。例如,在起始量为50 µL 的PCR中,只需0.1–1 ng质粒DNA,而gDNA则需要5–50 ng。最佳模板起始量还取决于所使用的 DNA 聚合酶类型;经过改造 的DNA聚合酶对模板的亲和力更强,灵敏度更高,所需的DNA起始量更少。对DNA起始量的优化很重要,因为起始量过高会增加发生非特异性扩增的风险,而起始量过低会降低得率(图 1)。

质粒和人类gDNA模板的PCR扩增结果对比

 

图 1.质粒和人类gDNA模板的PCR结果对比。在建议条件下,使用相同的DNA聚合酶从不同起始量的DNA模板中扩增2 kb目标序列。

有时候,PCR实验方案会使用拷贝数表示DNA起始量,特别是gDNA。拷贝数的计算取决于分子的数量,即DNA起始摩尔量。用Avogadro常数(L)和摩尔质量计算拷贝数,公式如下:

拷贝数=L x 摩尔数 = L x (总质量/摩尔质量)

特定DNA链的摩尔质量取决于其大小或总碱基数(即,其长度和单链或双链特性的组合)。为了简便,可使用 在线工具 从起始DNA的质量计算拷贝数。

理论上,单拷贝DNA或单个细胞在理想条件下足够用于PCR扩增。但在实际情况中,特定模板量的扩增效率很大程度上取决于反应组分和反应参数,以及DNA聚合酶的灵敏度。

除了gDNA、cDNA和质粒DNA,可通过再次扩增PCR产物,得到更高的目标DNA得率。尽管未纯化的PCR产物可以直接再次用作模板,但是引物、dNTP、盐和副产物等遗留反应成分会对扩增造成不利影响。为了避免这种抑制作用,通常建议在下一轮PCR前用水稀释反应。如需获取最佳结果,应在再次扩增前将PCR扩增子进行纯化。使用经优化的 PCR纯化试剂盒,仅需5分钟即可完成PCR产物纯化步骤。

DNA聚合酶

DNA聚合酶在目标DNA的复制中至关重要。TaqDNA 聚合酶应该算是最广为人知的PCR聚合酶了——它的发现 彻底改变了PCRTaqDNA 聚合酶具有相对较高的热稳定性,在 95°C下的半衰期约为40分钟[1]。在70°C时能够以每秒60个碱基的速度引入核苷酸,扩增长度约为5 kb,因此,它适用于无特殊要求的常规PCR。如今, 新一代DNA聚合酶 经过改进,PCR性能有了明显改善。

一般在50µL 反应中,1-2单位的DNA聚合酶已足够用于目标DNA的扩增。但是,对于难扩增模板,则需要调整酶的使用量。例如,当DNA样品含有抑制剂时,增加DNA聚合酶使用量有助于提高PCR得率。但是注意,提高酶浓度可能会产生非特异性PCR产物(图 2)。

对于PCR克隆、长片段扩增和高GC含量PCR等更为特殊的应用,应该使用 性能更高的DNA 聚合酶。这些酶能够在短时间内从长模板上扩增出PCR产物,错误率更低,得率更高,对抑制剂的耐受性更强(了解关于 DNA 聚合酶特性的更多信息)。

增加DNA聚合酶使用量有助于提高PCR得率

 


图 2:增加DNA聚合酶使用量有助于提高PCR得率,但可能会产生非特异性扩增子。
最上方条带代表目标PCR扩增子。

引物

PCR引物是含有15-30个碱基的合成DNA寡核苷酸。能够与模板DNA中目标区域的侧翼序列结合(通过序列互补)。在PCR反应期间,DNA聚合酶从 3′端开始延伸引物。因此,引物结合位点必须是靶标附近所特有的,并且与起始DNA的其它部分序列具有最小的同源性,以确保目的片段的特异性扩增。

除了序列同源性,引物还必须考虑到其它相关问题,,以确保PCR扩增的特异性。首先,引物序列的熔解温度(Tm)必须在 55–70°C之间,两种引物的 Tm相差不超过 5°C。同样重要的是,引物的序列不能具有互补性(特别是3’末端),若两个引物互补会促进退火(即,引物二聚体),自我互补会导致自我配对(即,二级结构),或序列的直接重复会导致与模板目标区域产生不完全配对。

此外,引物的GC含量最好在40-60%之间,均匀的C和G分布能够避免错误发生。同样,为了尽量减少非特异性,引物3′端最多只能含有3个G或C碱基。另一方面,引物3′端含有1个C或G核苷酸有利于引物的锚定和延伸(表 1)。为了简便,有多种 在线工具 可用于设计以及选择具有指定参数的最佳引物序列。

表 1.PCR引物设计的一般建议。

可以不可以
  • 长度为15–30 nt
  • Tm 55–70°C (两个引物相差不超过5°C)
  • 40–60% GC (均匀分布)
  • 3′末端含有1个C或G
  • 二级结构(互补性)
  • 直接重复序列
  • 3′末端含有3个以上G或C

长序列引物(如, >50 nt)或碱基经修饰的引物通常需要进行 纯化 ,以去除非全长产物和未结合的核苷酸。对于分子克隆和突变等应用,建议将引物进行纯化,序列和长度的完整性对于实验的成功至关重要。

为PCR克隆设计引物时,可在5'末端引入限制性酶切位点、重组序列和启动子结合位点等延伸的非模板序列。这些延伸序列需进行精心设计,以尽量减小对PCR扩增和下游实验应用的影响(了解关于 PCR克隆的更多信息)。

在配制PCR反应体系时,引物加入量应在0.1–1 μM范围内。对于含有简并碱基或用于长片段PCR扩增的引物,常用的引物浓度为0.3–1 μM 。通常,建议先使用标准浓度,然后根据需要再进行调整。引物浓度过高容易产生错配和非特异性扩增。而引物浓度过低可能会导致目的片段的少量扩增或无扩增(图 3)。

PCR amplification of human gDNA with varying concentrations of primers

图 3.使用不同浓度的引物对人类gDNA进行PCR扩增。 在该实验中,对富含GC的0.7 kb片段进行扩增。可以观察到,在高引物浓度下,会产生非特异性产物和引物二聚体。

脱氧核苷三磷酸(dNTP)。

dNTP由四个基本核苷酸组成——dATP、dCTP、dGTP和dTTP——是新DNA链的组成元件。这四种核苷酸通常以相等摩尔量加入到PCR反应体系中,以实现最佳的碱基引入。但是,在某些情况下,如通过PCR方法进行随机突变,偶尔也会使用浓度不等的dNTP,以促进非校正DNA聚合酶产生更多的错误碱基插入。

在常见的PCR应用中,各种dNTP的常用终浓度通常为0.2 mM。有时,使用高浓度dNTP也可能也是有益的,特别是在存在高浓度 Mg2+的情况下,因为Mg2+ 可与dNTP结合,减少可被引入的dNTP量。但同时,当dNTP超过最佳浓度时,会抑制PCR反应。为使DNA聚合酶完成有效扩增,反应中的游离dNTP浓度不得超过 0.010–0.015 mM(其估计 Km值)(图 4)。当使用非校正DNA聚合酶时,可通过降低dNTP浓度( 0.01–0.05 mM)和成比例减少 Mg2+来提高保真度。

使用不同浓度的dNTP对1 kb lambda DNA进行PCR扩增。

 


图 4.使用不同浓度的dNTP对1 kb lambda DNA进行PCR扩增。
每个反应中的MgCl2 终浓度为4 mM。

在一些应用中,dNTPs可能包含特殊核苷酸。例如,使用脱氧尿苷三磷酸(dUTP)替代dTTP,结合使用尿嘧啶DNA糖苷酶(UDG)预处理,以防止残余PCR产物污染[2]。UDG是一种DNA修复酶,能够剪切含有尿嘧啶的DNA链。使用dUTP替代dTTP,会生成含有尿嘧啶的PCR产物。在开始PCR前,使用UDG孵育反应样品,能够去除含有尿嘧啶的污染性残余PCR产物,从而防止残余PCR产物引起假阳性结果(图 5)。

UDG treatment for prevention of carryover PCR amplicon contamination

图 5.通过UDG处理,防止残余PCR扩增子污染。UDG切割DNA片段中的尿嘧啶碱基(红色线条)。经切割的DNA链在PCR条件下易于降解,因此不会在后续PCR中扩增。

在PCR中使用dUTP时,应注意如下事项。第一,dUTP取代可能会降低PCR效率和灵敏度。为克服这一问题,可采用最佳的dTTP和dUTP比例,使每个PCR产物分子携带足量的尿嘧啶碱基以有效完成UDG处理,而且不会明显影响PCR效率。第二,尽管 Taq DNA 聚合酶能够在DNA合成期间掺入dUTP,但 Pfu 等校正DNA聚合酶不能兼容dUTP,除非经过 特殊改造而可耐受尿嘧啶。这种特性主要是因为基于 Archaea的DNA聚合酶具有尿嘧啶结合口袋作为DNA修复机制[3,4]。

同样,氨基化dUTP、荧光素-12-dUTP、5-溴-dUTP和生物素-11-dUTP等改良型dNTP常被用于为后续实验加入标记物。与dUTP相似,DNA聚合酶必须能够引入经修饰的dNTP,以获得成功的PCR。

镁离子(Mg2+

镁离子(Mg2+)作为DNA聚合酶活性的辅助因子,有助于聚合期间dNTP的结合。酶活性位点处的镁离子可催化引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间形成磷酸二酯键(图 6)。此外, Mg2+ 能够稳定磷酸盐骨架上的负电荷,从而促进引物与DNA模板形成复合物(图 8)[5]。

DNA聚合酶活性位点处镁离子的作用


图 6.DNA聚合酶活性位点处镁离子的作用。
在DNA聚合期间,Mg2+ 可帮助协调引物的3′-OH与dNTP的磷酸基团间发生相互作用。

通常情况下,Mg2+ 以MgCl2 的形式提供。但是,因硫酸盐在某些情况下有助于确保更稳定和可重现的性能,诸如 Pfu DNA 聚合酶等一些聚合酶首选MgSO4。由于镁离子能够与dNTP、引物、DNA模板和EDTA(如果存在)结合,因此,通常需要对镁离子浓度进行优化,以尽量提高PCR得率,并保持其扩增特异性。

在PCR中,标准的 Mg2+ 终浓度范围为1–4 mM,建议优化滴定增量为0.5 mM。 Mg2+ 浓度过低会降低聚合酶活性,导致PCR产物较少或无PCR产物。另一方面, Mg2+ 浓度过高则会提高引物-模板复合物的稳定性,产生非特异性PCR产物,并增加由dNTP错误插入导致的复制错误(图 7)。

使用不同浓度的MgCl2进行PCR扩增

 


图 7.使用不同浓度的MgCl2进行PCR扩增。
最上方条带代表从人类gDNA扩增得到的2.8 kb目标片段。

缓冲液

PCR缓冲液能够为DNA聚合酶活性提供适宜的化学环境。缓冲液pH通常为8.0-9.5,一般使用Tris-HCl来调节。

对于 Taq DNA 聚合酶,缓冲液的一个常见成分是来自KCl的钾离子(K+),其可促进引物的吸附。有时,也可使用硫酸铵(NH4)2SO4 代替KCl。铵离子(NH4+) 具有去稳定作用,尤其对于错配引物-模板复合物碱基对之间的弱氢键,因此可增强反应特异性(图8)。

Effects of buffer ions on DNA duplex formation

图 8.缓冲液离子对DNA双链形成的影响。钾离子和镁离子 (K+和 Mg2+) 能够与DNA骨架上的磷酸基团 (P) 结合并稳定双链形成,而铵离子 (NH4+) 能够与碱基(N)之间的氢键相互作用并破坏双链形成。
 

由于 Mg2+ 与K+具有相似的稳定效应,因此,当使用KCl缓冲液时, MgCl2 的建议浓度通常较低(1.5 ± 0.25 mM) ,当使用(NH4)2SO4 缓冲液时,MgCl2的建议浓度通常较高 (2.0 ± 0.5 mM)。由于NH4+ 与Mg2+具有拮抗效应,因此,在各种 Mg2+ 浓度下,含有(NH4)2SO4 的缓冲液都表现出更高的引物特异性(图9)。由于最佳的PCR缓冲液取决于所使用的DNA聚合酶类型 ,所以有必要遵循酶供应商的提供的缓冲液建议。

PCR results from varying concentrations of MgCl2 in two different buffer types, illustrating importance of buffer choice for PCR specificity

图 9.使用含不同 MgCl2 浓度的两种不同缓冲液获得的PCR结果,表明选择合适缓冲液对于PCR扩增特异性的重要性。在该反应中,使用 Taq DNA 聚合酶从人类gDNA扩增0.95 kb的片段。
 

在某些情况下,可在缓冲液中加入化学添加剂或辅助溶剂,通过减少错配来提高扩增特异性,并通过去除二级结构来提高扩增效率(表 2)。此外,一些DNA聚合酶 还随附提供 了专为DNA聚合酶和PCR缓冲液优化的特殊增强剂 。这些试剂常用于困难样品,如富含GC的模板。应注意,使用化学添加剂或辅助溶剂会影响引物退火、模板变性、 Mg2+ 结合以及酶活性。同时,它们还会干扰某些下游应用——例如,基因芯片实验中的非离子去污剂。因此,为了成功进行PCR扩增和下游实验应用,应慎重考虑缓冲液组成成分。

表 2.用作PCR增强剂的常见添加剂或辅助溶剂,以及其建议终浓度[6]。

试剂标准终浓度
二甲基亚砜(DMSO)1–10%
甘油5-20%
甲酰胺1.25–10%
牛血清白蛋白(BSA)10–100 µg/mL
硫酸铵(NH4)2SO4)15–30 mM
聚乙二醇(PEG)5-15%
明胶0.01%
非离子去污剂(如,Tween 20, Triton X-100)0.05-01%
N,N,N-三甲基甘氨酸(甜菜碱)1–3 M

参考文献

资源
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仅供科研使用,不可用于诊断目的。