Note: This protocol is intended for use with the specific products mentioned within it. Substituting different products is not recommended.

简介

所有流式细胞分析都需要使用单细胞悬液。 因此，外周血细胞或悬浮细胞适用于流式细胞分析。 贴壁细胞、实体组织样品和肿瘤需要在分析前处理成单细胞混悬液。 许多可用的操作步骤可能涉及组织的酶解消化或机械解离。 当采用螯合或酶解消化时应小心，因为这些方法可能会破坏抗体表位。 在任何情况下，去除细胞团块、死细胞和细胞碎片对于消除假阳性并获得高质量结果都是至关重要的。

用于流式细胞分析的细胞制备操作步骤
实用网站

沃辛顿组织解离指南( http://www.tissuedissociation.com)
《沃辛顿组织解离指南》提供了关于各种组织解离方法的实用汇总和指南。

操作步骤 A： 组织培养细胞

材料

  • Invitrogen™ Accutase™ 酶细胞解离液（货号00-4555）或胰酶或乙二胺四乙酸(EDTA)
  • 流式细胞分析染色液（货号00-4222）
  • 15或50-mL锥形离心管

实验步骤

  1. 对于悬浮细胞，将细胞转移至锥形离心管中并进行细胞计数和活性分析。 然后转到第4步。
  2. 对于贴壁细胞，采用以下任意方法使细胞脱离培养板：
    • 细胞刮刀
    • 胰蛋白酶
    • EDTA（10 mM，溶于磷酸盐缓冲生理盐水）
    • Accutase酶细胞解离液
  3. 将细胞置于锥形离心管中并使用Invitrogen™ Pipetman™吹散所有细胞团块，然后进行细胞计数和活性分析。
  4. 离心细胞并将细胞重悬于合适体积的流式细胞染色液中，使细胞终浓度达到1 x 107 细胞/mL（其他细胞浓度可能适用于不同实验）
操作步骤B：淋巴组织

机械破碎淋巴组织常用于制备单细胞混悬液。

材料

  • 60 x 15 mm组织培养皿
  • 3-mL注射器或毛玻璃显微镜载玻片
  • 细胞过滤器（尼龙网）
  • 流式细胞分析染色液（货号 00-4222）或其他自选染色液
  • 15或50-mL锥形离心管

实验步骤

注释： 如果细胞将用于培养，应采用无菌技术和不含叠氮化物的染色液完成所有步骤。

  1. 将组织（脾；胸腺；淋巴结）收集至含有10 mL流式细胞分析染色液或其他自选染色液的组织培养皿中。 使用3-mL注射器挤压组织，使其分解成单细胞混悬液。 或者使用10 mL流式细胞分析染色液，将组织置于两个显微镜载玻片的磨砂面之间磨碎。
  2. 将细胞过滤器放在15或15-mL锥形管顶部。 使组织培养皿中的细胞通过细胞过滤器，以去除细胞团块和碎片。
  3. 在2-8°C下300-400 x g离心细胞悬液 4-5 分钟。丢弃上清液。
  4. 将细胞沉淀重悬于合适体积的流式细胞分析染色液或其他抗体推荐染色液中，然后进行细胞计数和活性分析。
  5. 采用第3步的方法离心细胞，并将细胞重悬于合适体积的流式细胞分析染色液或其他自选染色液中，使细胞终浓度达到1 x 107 细胞/mL（其他细胞浓度可能适用于不同实验）
操作步骤C：非淋巴组织

材料

  • 剪刀或刮刀
  • 磷酸盐缓冲生理盐水 (PBS) 或其他合适的生理缓冲液
  • 用于组织消化的酶
  • 60 x 15 mm组织培养皿
  • 3-mL注射器
  • 细胞过滤器（尼龙网）
  • 流式细胞分析染色液（货号 00-4222）或其他自选染色液
  • 15或50-mL锥形离心管

实验步骤

注释： 如果细胞将用于培养，应采用无菌技术和不含叠氮化物的染色液完成所有步骤。

  1. 收集组织并用剪刀或刮刀将其切成2-4 mm碎块。
  2. 根据酶的使用说明书，加入合适体积的酶（溶剂为 PBS），并在最佳温度下孵育合适的时间。
  3. 用移液器轻轻吹散细胞并使用细胞过滤器过滤，以去除细胞团块和碎片。 将细胞混悬液收集到锥形管中。
  4. 在2-8°C下300-400 x g离心细胞4-5分钟。丢弃上清液。
  5. 将细胞沉淀重悬于PBS中。
  6. 采用第4步的方法离心细胞。
  7. 重复第5步和第6步。
  8. 将细胞沉淀重悬于合适体积的流式细胞分析染色液或其他抗体推荐染色液中，然后进行细胞计数和活性分析。
  9. 采用第4步的方法离心细胞，并将细胞重悬于合适体积的流式细胞分析染色液或其他自选染色液中，使细胞终浓度达到1 x 107 细胞/mL（其他细胞浓度可能适用于不同实验）。
操作步骤D：从全血中分离PBMC

材料

  • PBS：
  • Ficoll 密度梯度离心法或其他密度梯度离心介质
  • 流式细胞分析染色液（货号 00-4222）或其他自选染色液
  • 15或50-mL锥形离心管

实验步骤

注释： 如果细胞将用于培养，应采用无菌技术和不含叠氮化物的染色液完成所有步骤。

  1. 使用PBS将血细胞按1:1比例稀释于锥形管中。
  2. 在稀释的样品中加入与原始样品相同体积的Ficoll。
  3. 在室温以400 x g离心20分钟，把“BRAKE（制动）”开关放置在“OFF”档。
  4. 将PBS和Ficoll层交界处的PBMC收集至新管中。
  5. 向管中加入PBS，清洗细胞。
  6. 在2-8°C下300-400 x g离心细胞4-5分钟。丢弃上清液。
  7. 将细胞沉淀重悬于合适体积的流式细胞分析染色液或其他精选染色液中，然后进行细胞计数和活性分析。
  8. 采用第4步的方法离心细胞，并将细胞重悬于合适体积的流式细胞分析染色液或其他自选染色液中，使细胞终浓度达到1 x 107 细胞/mL（其他细胞浓度可能适用于不同实验）