克隆基础支持 – 问题排查

一些可能的原因及补救措施如下：

• 连接酶活性低。检查连接酶生产日期以及缓冲液的功能。
• 感受态细胞没有转化能力。使用超螺旋载体，如puc19，检测感受态细胞效率。
• 两个片段都已去磷酸化。
• 限制性内切酶及残留的缓冲液抑制连接反应。不妨尝试转化未切割载体，使用苯酚去除内切酶，或者连接前进行PCR产物纯化／胶回收。
• 抗生素使用错误。检查质粒及培养板并确保使用了正确浓度的抗生素。

如果以上均不适用，转化后克隆数低或没有克隆可能是由于DNA插入片段在感受态细胞中不稳定造成的。此种情况下，Stbl2™、Stbl3™、或Stbl4™等大肠杆菌菌种对于有多片段重复的DNA、反转录病毒序列、及高GC含量的DNA扩增的效果优于其它菌种。

这可能是由于插入DNA在TOP10大肠杆菌中不稳定造成的。此种情况下，Stbl2™、Stbl4™等大肠杆菌菌种对于有正向重复的DNA、反转录病毒序列、及高GC含量的DNA扩增的效果优于其它菌种。

其中一个原因是可能与插入片段的毒性有关。这种毒性不能影响在固体培养基上缓慢生长的细胞，但是在快速生长条件（如液体培养基中）下，其毒性更强。建议：

1. 使用TOP10F’或其他带有LacIq阻抑物的菌种。
2. 尝试使用任何其它的适用于克隆的菌株。
3. 将培养温度降至27至30摄氏度并延长培养时间。
4. 不生长的另一可能的原因是噬菌体污染。此种情况下，我们推荐使用具有T1噬菌体抗性的菌株，如DH5α-T1R。

如果插入片段对于宿主细胞有潜在毒性，您可以尝试以下建议：

• 转化TOP10或DH5α细胞后，在25-30摄氏度而不是在37摄氏度下孵育。这会降低生长速度并能提高克隆具有潜在毒性的插入片段的几率。
• 尝试使用TOP10F’细胞进行转化，但是不在培养板中加入IPTG。这些细胞带lacIq阻抑物抑制从lac启动子起始表达，因此能克隆毒性基因。请注意，没有加入IPTG时不能进行蓝白斑筛选。
• 尝试使用Stbl2细胞进行转化。

这些小的克隆很有可能是由于氨苄活性降低产生的。这些克隆是生长在氨苄活性降低的LB培养板上的未转化细胞。为了避免这种情况，你可以尝试：

1. 降低细胞铺板密度。
2. 使用新鲜的LB氨苄培养板或者用羧苄青霉素代替氨苄青霉素。
3. 培养板不能在37摄氏度下孵育超过20小时。β-内酰胺酶是一种由氨苄抗性基因产生的酶，它由具氨苄抗性的转化菌分泌，能够使转化的菌落周围的抗生素失活。由于筛选试剂的失活而使得卫星菌落（不是真正的氨苄抗性）能够生长。如果使用羧苄青霉素也会产生同样情况。