Pierce™ 交联磁性 IP/Co-IP 试剂盒

Thermo Scientific Pierce 交联磁性 IP/Co-IP 试剂盒使用交联化学方法将 IP 抗体共价固定在优质蛋白 A/G 磁珠上，以实现有效的免疫沉淀和免疫共沉淀。

因为该磁性 IP 程序涉及用于免疫沉淀的特异性抗体的共价结合，所以可在不使用抗体片段的情况下洗脱和分析靶蛋白或 co-IP 蛋白复合物，原因是该抗体仍黏附在微珠上。该试剂盒包含优化的方案以及使用与蛋白 A/G 结合的抗体和手动或自动磁性分离工具用于获得高得率 IP 或 co-IP 所必需的所有缓冲液和试剂。

交联磁性 IP/Co-IP 试剂盒的特点：

•无抗体 IP—抗体与磁珠不可逆地连接，使得完整抗体或含有纯化抗原的重链和轻链的共洗脱可忽略不计
•便利—IP/co-IP 试剂盒包含磁珠以及所有用于理想免疫沉淀所必需的缓冲液
•快速—可在 3 小时内完成交联和免疫沉淀
•高效—与其他磁珠相比，使用一半推荐体积的磁粒子进行免疫沉淀
•兼容—与蛋白 A/G 重组蛋白偶联的磁珠可确保与大多数一抗（无论来自小鼠还是兔）兼容
•可扩展—仅需使用少量抗体即可进行单次 IP 实验或制备更大数量的抗体交联磁珠进行多次实验

Pierce 交联磁性 IP/Co-IP 试剂盒的方案为使 IP 抗体与蛋白 A/G 磁性微珠结合，然后使用辛二酸二琥珀酰亚胺酯 (DSS) 将抗体共价交联至微珠。然后将抗体交联微珠与含有目标蛋白抗原的细胞裂解物或组织提取物一起孵育，使得抗原:抗体复合物可以形成。洗涤微珠以去除未结合的材料，并使用低 pH 值洗脱缓冲液从抗体-交联微珠分离结合的抗原。包括中和缓冲液，以防止分离抗原沉淀，并确保下游应用中的蛋白活性。包含用于制备 SDS-PAGE 分析样品的泳道标志物样品缓冲液。该方案针对 2 至 10 µg IP 抗体进行了优化。为获得较佳 co-IP 得率，使用 5 至 10 µg 抗体。使用磁力架手动从溶液中取出磁珠或者使用 Thermo Scientific KingFisher Flex 仪器等仪器通过自动化操作从溶液中取出磁珠。

传统 IP（无共价抗体连接）的抗原得率通常高于使用交联的 IP 方案。这是因为交联过程不可避免地会引起一些功能性抗体结合位点的损失。为了克服交联方法的这一限制，在交联 IP 方法中需要使用的 IP 抗体量可能多于等效传统 IP 程序。当然，交联免疫沉淀程序的优势在于 Western 印迹无干扰抗体条带。

方案总结
1：用 1X 偶联缓冲液预洗微珠。
2：使抗体与蛋白 A/G 磁珠结合 15 分钟。
3：用 1X 偶联缓冲液洗涤微珠三次。
4：使用 DSS 将抗体交联至微珠，持续 30 分钟。
5：用洗脱缓冲液洗涤微珠三次，然后用 IP 裂解/洗涤缓冲液洗涤两次。
6：将细胞裂解物与制备的微珠在室温下孵育 1-2 小时或在 4°C 下过夜孵育。
7：用 IP 裂解/洗涤缓冲液洗涤微珠两次，然后用纯化水洗涤一次。
8：洗脱结合抗原。

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