LAG-3 小鼠 ProcartaPlex™ Simplex 试剂盒

下述方案已经应用于多种人类和小鼠细胞系。您应该为您自己的应用优化细胞提取操作。

细胞裂解操作

非贴壁细胞：
低速离心以沉淀细胞。从沉淀中移去培养基，用冰冷的PBS洗涤两次。去除PBS，将细胞沉淀重悬于细胞裂解缓冲液中（推荐细胞裂解液浓度为2-5 mg/mL）。在冰上孵育15分钟，偶尔涡旋。将裂解物转移至微量离心管中，并在2-8℃下以14000rpm离心10分钟。 将澄清的裂解液等分至干净的微量离心管中，并测定总蛋白浓度。

贴壁细胞：
从细胞中去除培养基，用冰冷的PBS洗涤两次。去除PBS，加入细胞裂解缓冲液（推荐细胞裂解液浓度为2-5μg/mL），并在冰上孵育15分钟。收集细胞裂解液，并将其转移至微量离心管中。在2-8℃下以14000rpm离心10分钟。 将澄清的裂解液等分至干净的微量离心管中，并测定总蛋白浓度。裂解液应在-80°C下冷冻储存，或在收集后立即进行分析。冷冻样品避免多次反复冻融。分析前，将样品完全解冻、充分混合并通过离心（14000rpm，10分钟）来澄清，以防止堵塞过滤板。

推荐的细胞裂解缓冲液：

NP40细胞裂解缓冲液（货号FNN0021）
注意：使用NP40裂解缓冲液制备的裂解液必须在检测之前稀释至少5倍。
或者使用下述配方进行配置：50 mM Tris，pH 7.4，50 mM NaF，260 mM NaCl，1 mM Na3VO4，5 mM EDTA，0.02% NaN3，1% Nonidet P40

NP40细胞裂解缓冲液（不含蛋白酶抑制剂混合物和PMSF）在2-8°C下的稳定期为2-3周，或在-20°C下分装保存6个月。

使用前在NP40细胞裂解缓冲液中新鲜添加：
•1 mM PMSF（DMSO中的0.3 M原液）
•蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，货号P-2714）

替代细胞提取缓冲液

细胞提取缓冲液（货号FNN0011）
注意：使用细胞提取缓冲液制备的裂解液必须在检测之前稀释至少10倍。

或者

10 mM Tris，pH 7.4
2 mM Na3VO4
100 mM NaCl
1% Triton X-100
1 mM EDTA
10% 甘油
1 mM EGTA
0.1% SDS
1 mM NaF
0.5% 脱氧胆酸盐
20 mM Na4P2O7

细胞提取缓冲液（不含蛋白酶抑制剂混合物和PMSF）在2-8°C下的稳定期为2-3周，或在-20°C下等分保存6个月。

使用前在细胞提取缓冲液中新鲜添加：
•1 mM PMSF（DMSO中的0.3 M原液）
•蛋白酶抑制剂混合物（Sigma，货号P-2714）

我们建议遵循下面提供的的方案，这是基于组织提取试剂I（货号FNN0071）开发并显示了ELISA和Luminex技术之间的良好相关性。该方法已应用于多种组织类型。但是，我们建议您针对所使用的每种组织样品进行优化。可以使用类似的提取试剂/裂解缓冲液。

1.在使用前将蛋白酶抑制剂添加到组织提取试剂中。
2.称量组织样品。
3.每1克组织加入10 mL组织提取试剂。
4.匀化组织。
5.以10000rpm离心样品5分钟以沉淀组织碎屑。
6.收集上清液。按照试剂盒中提供的操作步骤进行适当的稀释；这是为了防止/最小化提取液或裂解缓冲液中存在的去垢剂对抗体 - 抗原结合的潜在抑制。通常，组织匀浆或细胞裂解物（取决于所用的裂解缓冲液）需要稀释5至10倍，以将去垢剂浓度降低至≤0.01％。然而，基于目标细胞因子/蛋白质的浓度，不同的试剂盒/样品可能需要用检测稀释液或标准品稀释液进一步稀释。

注意：如果要储存样品，请将其等分并冷冻于-80°C。避免多次反复冻融。

Unfortunately, we do not currently offer a Mac-compatible version of the ProcartaPlex Analyst Software. ProcartaPlex Analyst Software is compatible with PC, or xPONENT Software is available on Luminex instruments to analyze your data.

Find additional tips, troubleshooting help, and resources within our Protein Assays and Analysis Support Center.

Here are possible causes and solutions:
- The wrong cell culture media may have been used to prepare the standards. We recommend using the same cell culture media that was used to culture the cells.
- The samples and antigen standards may not have been stored on ice. We recommend preparing the samples and standards on ice before setting up the assay.

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Standards may not have been reconstituted and diluted correctly. We recommend preparing fresh antigen standards following the instructions provided in the corresponding ProcartaPlex user guide.

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