NuPAGE™ 4-12%，Bis-Tris，1.0–1.5 mm，小型蛋白凝胶

•将Tris-甘氨酸转膜缓冲液的pH增加至9.2，可使pl低于9.2的所有蛋白质朝阳极方向迁移。
•使用Tris-甘氨酸转膜缓冲液，并在凝胶两侧各放一张膜。碱性高于转膜缓冲液pH的蛋白质，将被凝胶阴极侧的膜捕获。随后，可以用相同的方式处理两张膜。
•转印前，将凝胶置于含0.1% SDS的Tris-甘氨酸转膜缓冲液中孵育15分钟。少量的SDS会给予蛋白质足够的电荷，使蛋白质朝阳极端单向移动，并且在大部分情况下不会使蛋白质变性。然后，使用常规Tris-甘氨酸转膜缓冲液进行转印。

NuPAGE Bis-Tris凝胶在Invitrogen半干转仪中的转印效率不如在XCell II转印模块中高。如果您决定使用Invitrogen半干转仪进行NuPAGE -Tris凝胶转印，则应使用下述实验方案以确保蛋白质的有效转印。

1.如下所述，使用20X NuPAGE转膜缓冲液制备100 mL的2X NuPAGE转膜缓冲液：
NuPAGE转膜缓冲液（20X）10.0 mL
NuPAGE抗氧化剂（用于还原型样品）0.1 mL
甲醇10.0 mL
去离子水79.9 mL
总体积100 mL
如果您转印的是大分子蛋白质，请参见下方备注。

2.在转膜缓冲液中浸泡滤纸和印迹膜。如果您在使用Invitrogen预切膜/滤纸三明治，则应在凝胶或膜的外侧分别使用3张滤纸（每张滤纸厚0.4 mm）。如果您未使用Invitrogen预切膜/滤纸三明治，则使用2张厚滤纸。

3.将凝胶置于转膜缓冲液（中型凝胶使用100 mL，小型凝胶使用50 mL）中，放置在定轨摇床上平衡10分钟，从而去除转印液中的盐，以避免电导率和产热的增加。

4.如下所述，在阳极板上装配凝胶/膜/滤纸三明治：
滤纸
滤纸
滤纸
滤纸
膜
凝胶
凝胶
凝胶

5.在20 V恒定电压条件下转印30-60分钟。

备注：转印大分子量蛋白质（>100 kDa）时，可在装配三明治前，将凝胶置于含0.02-0.04% SDS 的2X NuPAGE转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟。

氯丁醇可用作NuPAGE转膜缓冲液的防腐剂，但对于蛋白质的有效转印并不是必要的。若配制缓冲液时未加入氯丁醇，则应注意缓冲液不能长期稳定保存。建议在配制后2周内用完。

我们不建议使用碳酸盐或CAPS转膜缓冲液进行NuPAGE凝胶转印，因为这会降低转印效率。此外，这些缓冲液的高pH环境（>pH 9）会使NuPAGE抗氧化剂丧失功能。

为提高NuPAGE凝胶上大分子蛋白[高分子量蛋白]的转印效率，我们建议在安装“三明治”前，将凝胶置于含有0.02–0.04% SDS的2x NuPAGE转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含甲醇和0.01%SDS的1XNuPAGE转膜缓冲液进行转印。