Bolt™ 蛋白质印迹套装 B (PVDF)

电流异常升高的最常见原因是转膜缓冲液。如果转膜缓冲液浓度太高，会导致电导率增加和电流升高。如果不小心用Tris-HCl代替了转膜缓冲液所需的Tris base，也会导致高电流。Tris-HCl可使缓冲液pH降低，引起电导率和电流升高，从而导致过热。我们建议检查转膜缓冲液及其试剂成分，然后重新稀释或重新配制缓冲液。

•将Tris-甘氨酸转膜缓冲液的pH增加至9.2，可使pl低于9.2的所有蛋白质朝阳极方向迁移。
•使用Tris-甘氨酸转膜缓冲液，并在凝胶两侧各放一张膜。碱性高于转膜缓冲液pH的蛋白质，将被凝胶阴极侧的膜捕获。随后，可以用相同的方式处理两张膜。
•转印前，将凝胶置于含0.1% SDS的Tris-甘氨酸转膜缓冲液中孵育15分钟。少量的SDS会给予蛋白质足够的电荷，使蛋白质朝阳极端单向移动，并且在大部分情况下不会使蛋白质变性。然后，使用常规Tris-甘氨酸转膜缓冲液进行转印。

对于大于100 kDa的蛋白质，我们建议在组装三明治前，将凝胶置于含有0.02-0.04% SDS的2XNuPAGE转膜缓冲液（无甲醇）中预平衡10分钟，然后使用含甲醇和0.01%SDS的1XNuPAGE转膜缓冲液进行转印。

以下是可能原因和解决方案：

•凝胶与膜之间存在气泡，阻碍了蛋白质转印。应确保用玻璃吸管滚过膜表面，除去凝胶与膜之间的所有气泡。
•使用了过期或有折痕的膜。应使用新的、无破损的膜。

条带呈旋涡状和扩散状通常是因为分子在与膜结合前发生了横向移动。以下是可能原因和解决方案：

- 凝胶与膜接触不良：凝胶应与膜通过毛细管作用粘在一起，因此，应使用玻璃吸管滚过凝胶/膜三明治的每一层表明，使凝胶与膜良好接触。在组装三明治时，使用一次性吸管在每一层多加一点转膜缓冲液，也有助于凝胶与膜的接触。此外，应完全浸透海绵垫（戴上手套，将海绵垫置于转膜缓冲液中并向下压，挤出所有气泡）。
- 对凝胶的压力不足：凝胶/膜三明治必须牢固装在两部分印迹模块之间。尝试多加一个海绵垫或将失去弹性的海绵垫换成新的。
- 过度挤压凝胶：过度挤压的一个明显表现是凝胶过于扁平。在三明治被过度挤压的情况下，应适当移除海绵垫，降低对凝胶和膜施加的过多压力即可合拢转膜模块。

注意：未压缩海绵垫的高度应比密封垫片高0.5–1.0 cm。