LiveBLAzer™ FRET-B/G 上样试剂盒（含 CCF2-AM）

背景：
GeneBLAzer™ 细胞分析利用带负电荷的荧光 β-内酰胺酶底物（CCF2 和 CCF4）的膜可穿透的酯形式（CCF2-AM 和 CCF4-AM）进行检测。这些亲脂性酯很容易进入细胞，进入细胞后，内源性细胞质酯酶将其裂解，使之快速转化为带负电荷的形式，之后细胞溶质将其捕获。

GeneBLAzer™ 分析是基于 FRET 进行检测的。每种底物用两个形成高效 FRET 对的荧光基团进行标记。在无 β-内酰胺酶活性的情况下，在 409 nm 激发完整 CCF2 分子中的香豆素会使荧光共振能量转移至荧光素，使荧光素发出 518 nm 的绿色荧光信号（图 1）。然而，在有 β-内酰胺酶活性的情况下，CCF2 的裂解会使两种染料在空间上分离，并干扰荧光共振能量转移，此时如果用 409 nm 的光激发香豆素，产生的将是 447 nm 的蓝色荧光信号。这种蓝色信号在显微镜下很容易观察到，也可以通过荧光微孔板酶标仪上检测蓝色通道的读数增加来检测。

CCF2-AM 和 CCF4-AM 底物是 GeneBLAzer™ 平台必须的分析组分。这些底物与流式细胞分析仪完全兼容，可提高克隆选择的速度。蓝色和绿色信号的比值分析能降低由细胞数量和底物上样量不同引起的孔间差异，从而获得高 Z´ 因子值和低变异系数（Coefficients of Variation，以下简称 CV）。

CCF2-AM 和 CCF4-AM 的区别在于连接香豆素基团与内酰胺环桥连的两个碳不同。两者都是膜可穿透的酯化形式，适用于完整细胞分析。CCF4-AM 的溶解性优于 CCF2-AM（在 >24 小时内溶解），因而较适合筛选应用。此外，CCF4-AM 的 FRET 略优于 CCF2-AM，因此背景略低于 CCF2-AM。

CCF2-FA 本质上是 CCF2 底物，只不过没有 AM 版本中所含的酯。CCF2-FA 经过去酯化，可用于细胞裂解，省去跨细胞膜上样和去酯化的步骤。如果使用的细胞包含细胞壁，则细胞裂解是首选方法。CCF2-FA 还可用作对照品，以获取 CCF2-AM 和 CCF4-AM 的激发和发射光谱。