PCR抑制剂：如何克服PCR中的抑制

在首期《Absolute Gene-ius》科学速览中，主持人Jordan Ruggieri和Lisa Crawford重新审视了专家们对一个持续存在的分子生物学难题——PCR抑制剂的见解。在废水监测、环境微生物学以及基因治疗制造等领域，抑制剂会扭曲PCR数据并使定量分析变得复杂。

本集节目邀请了Ray Ketchum博士、Sarah Philo博士、Patrick Hanington博士、Dave Bauer博士、Kimberly Gomez和Min Jin Kim博士，从他们的视角探讨为何会发生抑制现象，以及当精确性至关重要时，数字PCR（dPCR）如何成为一种具有韧性的检测方法。

收听完整节目请访问thermofisher.com/absolutegeneius.

什么是PCR抑制剂，它们为何重要？

PCR抑制剂如何影响分子实验流程？

PCR抑制剂是与DNA或RNA共同提取的物质，会干扰聚合酶活性、扩增效率或荧光检测。它们在废水、土壤和病毒载体等复杂样品中尤其常见。

样品前处理通常是第一道防线，但并不总能解决问题。

DNA提取会引入偏差吗？

在第一季第五集，Ray Ketchum博士讨论了一个鲜为人知的问题：复杂微生物样品中的DNA提取偏差。

DNA提取偏差如何影响定量结果？

Ray Ketchum博士解释道：

“我们实际上还没有做实时PCR和数字PCR的比较，看看是否存在差异。我认为不会有太大差异，主要是因为DNA的提取方式。大多数抑制剂应该都被去除了。但我们最近遇到了另一个问题，我认为整个行业也开始越来越关注这个问题，那就是，当你处理复杂的细菌集合并对其进行联合分析时，无论是来自人类肠道微生物组、土壤微生物组还是其他来源，人们一直假设你的DNA提取能够同样有效地从所有细菌中提取DNA。而事实并非如此。在我们的案例中，我们发现很多细菌都是孢子形成型。如果它们形成了孢子，我们很难真正获得能代表产品实际情况的DNA。结果发现，我们一直严重低估了产品中实际含有的数量。所以这些就是我们遇到的一些问题。”

这凸显了PCR工作流程中的两个关键挑战：

• 抑制剂可能无法完全去除。
• 提取效率低下会扭曲真实的生物学表现。

这两项问题都会直接影响准确定量。

为什么数字PCR为何具有良好的稳健性？

在多季《Absolute Gene-ius》节目中，科学家们在处理富含抑制剂的样品时，一致报告对数字PCR结果更有信心。

在废水监测中会发生什么？

废水以其复杂性而闻名，含有有机物、化学品和微生物残留，这些成分会干扰qPCR的效率。

为什么在废水样品中dPCR的表现优于qPCR？

Sarah Philo博士分享道：

“我们用qPCR和dPCR检测了一些不同的抗菌素耐药基因。几乎所有基因在dPCR中的定量结果都高于qPCR，这很合理，至少从废水和环境样品中存在的大量抑制剂来看，这些抑制剂往往会让qPCR效率降低。我可以说，我们在数字PCR中检测到的基因拷贝数比在qPCR中检测到的要高。这是废水领域的一个大问题。就像你提取所有东西时，很多时候抑制剂也依然存在，因为废水里有很多难以清除的成分。已经很明确的是，传统PCR和qPCR确实会受到这些抑制剂影响，而数字PCR则较少受此影响。”在废水监测和抗菌素耐药性监控中，这种差异会显著影响数据解读和公共卫生决策。

那么含有蓝藻的环境水样又如何？

环境研究人员经常遇到来自沉积物和藻华带来的抑制作用。

数字PCR如何帮助解决环境样品中的PCR抑制问题？

Patrick Hanington博士解释道：

“我们使用qPCR（定量聚合酶链反应）经验丰富。而就在几年前，我们意识到，在环境背景下使用qPCR的一些局限性已经被数字PCR很好地解决了。其中最大的问题就是样品中的PCR抑制剂，因为我们经常处理水样。我想你们可能没去过阿尔伯塔，但这里的湖泊非常浑浊。我并不是要贬低它们，只是事实如此。我们的每一个阿尔伯塔中部湖泊都有蓝藻（蓝绿藻）藻华，我们一直在与 PCR 抑制剂、蓝藻作斗争。当然，我们可以对DNA进行清理操作。在DNA提取时，可以尝试稍微净化一下样品，而且通常这些方法能有效去除部分抑制剂。但只需一点点残留就能影响qPCR反应。而数字 PCR，从我们的角度来看，它最大的优势之一就是能够更好地减少抑制剂对反应的影响。这是我们认为在环境领域最重要的一大优势。”

对于从事环境微生物学研究的科学家来说，减少抑制物的干扰是获得可靠定量结果的关键。

是什么让dPCR比其他PCR技术对抑制剂更具抗干扰能力？

在技术层面上，区别在于定量方式的不同。

当存在抑制剂时，为什么qPCR中的Ct值偏移会成为问题？

Dave Bauer博士为您详细解析：

“我喜欢总结几个要点，这是我认为dPCR有价值的地方之一。如果你的样品中含有抑制剂，如果它们是比较‘脏’的样品，这可能会影响实时PCR中的酶活性，你就必须依赖从反应开始到信号穿过Ct阈值这整个过程的反应效率。只要这个过程中效率发生变化，你得到的结果和浓度也会改变。然而，对于数字PCR来说，因为它是二元的——‘有没有信号’，我并不关心你是否能看到单个微反应中的扩增曲线，即使扩增很慢、效率很差也没关系，只要循环结束时信号超过背景噪音云，无论如何都算作阳性。因此，这赋予了你对抗抑制剂极强的鲁棒性。另一个优势是多重检测，因为很多时候，在实时PCR中做多重检测时，不同引物和探针体系之间的混合会影响各自的效率，所以用实时PCR做四重定量分析很难，但用数字PCR则容易得多，可以在同一反应中用不同颜色染料同时检测多个靶标，因为我们不关心效率。”由于数字PCR依赖终点、二元检测而不是扩增效率和标准曲线，因此其本质上对部分抑制作用不那么敏感。

抑制剂如何影响基因治疗和病毒载体流程？

在AAV生产和病毒载体制造过程中，抑制剂可以来自缓冲液、蛋白质以及复杂的生产基质。

dPCR在基因治疗流程中有哪些优势？

Kimberly Gomez解释道：

“使用qPCR时，通常需要运行一个标准曲线。你会制作一系列稀释梯度，并与未知浓度样品一起运行，然后根据标准曲线推算出样品浓度。但大问题在于，有时候你的标准曲线可能是由参考材料（比如不同种类AAV）或质粒制作而成。因此，准备和制作标准曲线的方法会极大影响你最终通过该标准曲线获得的浓度结果。另外一点需要考虑的是，qPCR对于抑制剂没有那么强的鲁棒性。而我们发现，用dPCR面对不同类型基质时具有更高的鲁棒性。这是一个很大的优势，尤其是在你从病毒生产流程中不同环节取样的时候。”

金敏珍博士补充道：

“所以基本上，总结来说，qPCR虽然非常常用，至少在我们这个领域里，现在每个人都知道如何使用qPCR。但它也有一些局限性，比如像Kim提到的，需要标准曲线，这可能会影响实际结果的准确性和精确度。另一个问题是, 抑制效应在qPCR中比数字PCR更为普遍，因为qPCR通常是在较大体积样本制备的情况下进行。在这种情况下，有时在AAV应用中，你需要从生产过程中的不同阶段取样，这些样品会包含不同的蛋白质、不同的缓冲液，它们具有不同的抑制效应。在这种情况下，qPCR在忽略或减轻这种影响方面会更加有限，而数字PCR则表现更好。此外，从精确度角度来看，建议qPCR对每个样品至少做三次重复，这会增加所需样本量。而数字PCR，尤其是我们的Absolute Q，不仅输入样本量较低，而且几乎没有死体积，有助于保存你的样本。除此之外，由于它是绝对定量, 理论上并不需要做任何重复实验，因此你可以在一个阵列中运行一个样品。还有一个优势是，在数字PCR上可以进行一些其他分析，而这些分析在qPCR上无法实现，比如关于目标基因分子完整性的分析。”

要点总结：当定量很重要时，应尽量减少抑制风险

从废水监测到环境微生物学以及病毒载体生产，PCR抑制剂无处不在。即使优化了样本准备流程，残留的抑制作用和提取偏差仍可能通过改变Ct值或影响效率而扭曲结果。

数字PCR是一种很好的方法，可以帮助减轻这些偏差带来的影响。

当准确定量至关重要时，选择能够最大程度减少抑制剂影响的技术，可以带来显著改善。

想要收听完整讨论并探索更多关于PCR、dPCR及分子工作流程的专家见解，请收听本期节目：《Absolute Gene-ius》：科学速览 （详见thermofisher.com/absolutegeneius）并且一定要探索该系列的其他集。

如需了解更多关于数字PCR及其如何为您的研究增值的信息，请访问thermofisher.com/dPCR.