流式检测细胞内磷酸化蛋白

什么是蛋白磷酸化？

磷酸化是一种关键的蛋白质修饰形式。蛋白质就像是一群在细胞内忙碌的小人，磷酸化就像是让这些小人喝下的“超级能量饮料”，使其变得更加活跃、高效。磷酸基团（PO4³⁻）通过蛋白激酶的作用被添加到蛋白质上，这个过程就叫做蛋白磷酸化。但是，喝了能量饮料的小人也需要休息，这时候就需要蛋白磷酸酶来移除磷酸基团，让小人们恢复常态。

图1. 磷酸化信号网^[1]

这个动态过程在细胞信号传导、代谢调控、细胞周期等多个生物过程中扮演着关键角色。蛋白磷酸化异常，可能导致疾病，如癌症和糖尿病。研究蛋白磷酸化可以揭示生命运作的奥秘，并为开发新治疗方法提供线索。

为什么要用流式检测蛋白磷酸化？

传统检测方法如Western Blot和2D电泳在高通量及单细胞水平检测存在局限。流式细胞术就像一个超级高效的分拣机器人，利用特异性磷酸化抗体这个抓手，能在几分钟内从成千上万个细胞中找到磷酸化蛋白，进行高通量及单细胞水平检测，极大提升了检测的灵敏度和准确性。

如何用流式检测蛋白磷酸化？

实验流程主要分为三个部分：

样品制备^【2】

合适的磷酸化刺激条件和动力学需根据细胞类型和所测定的信号传导事件而定。

我们测试了不同因子处理U937细胞，使用pSTAT6（克隆CHI2S4N）APC抗体（货号# 17-9013-41）进行细胞内染色的效果。 从结果看，只有IL-4的处理激活了STAT6的磷酸化。

Red：untreated，Blue：treated^[3]

样品固定和通透，使用荧光标记的磷酸化抗体染色^【2】

我们测试了pZAP70/Syk（克隆 n3kobu5）PE抗体（货号# 12-9006-41）对于三种不同固定通透条件的耐受性：胞内固定破膜缓冲液(货号# 88-8824，左)、Foxp3/转录因子固定破膜缓冲液(货号# 00-5523，中)及胞内固定缓冲液(货号# 00-8222)/甲醇破膜处理（右）。结果显示该抗体能够耐受三种不同的固定通透方法。

Red：untreated，Blue：treated (blue histogram) with H₂O₂-activated sodium pervanadate for 5 minutes at 37°C. ^[3]

流式上机和数据分析^【2】

一般需要比较未刺激和刺激的样品进行数据分析。

实验步骤

以常用的、适用于很多磷酸化抗体的胞内固定缓冲液/甲醇破膜处理为例。

1. 在适当的培养基中培养目标细胞用于刺激。
2. 计数细胞，在适当的培养基中重悬至1-5×10⁶个细胞/mL。
3. 37°C下，选用适当的时间点刺激细胞。同时孵育未处理的细胞，作为阴性对照。
4. [可选] 固定之前进行表面染色，使用耐甲醇荧光染料偶联的抗体。
5. 在刺激结束时，在细胞中加入等体积的流式胞内固定液（货号# 00-8222）并涡旋振荡，固定细胞以终止刺激。
6. 室温避光孵育细胞10-60 min。
7. 室温600 x g离心细胞4-5 min，弃上清。
8. 用残留体积重悬细胞，加入1 mL预冷的90-100％甲醇，涡旋振荡，置于4°C或冰上孵育至少30 min。
9. 用过量体积的流式细胞染色液洗涤细胞。
10. 室温600 x g离心细胞4-5 min，弃上清。
11. 用流式细胞染色液以1×10⁷个细胞/mL重悬细胞，并将1×10⁶个细胞（100 μL）等分到单独的流式管中。
12. [可选] 染色前，使用纯化的抗小鼠CD16/CD32（货号# 14-016）或人Fc受体结合抑制剂（货号# 14-9161）封闭。
13. 每管加入推荐量的荧光标记抗体，室温避光孵育30-60 min，。
14. 加入2 mL流式细胞术染色液，室温600 x g离心4-5 min，弃上清。
15. 重复第14步。
16. 将染色细胞重悬于适当体积的流式细胞术染色液中，流式细胞仪上机分析。

常见Question & Answer

Q 我购买了一只磷酸化抗体要做流式检测，请问要用哪种固定和通透方法？

A 针对不同靶点的磷酸化抗体，请参考抗体的说明书上推荐的固定和通透条件。我们对于很多磷酸化抗体测试了上面提及三种固定通透条件，点击了解更多信息。

Q 如何同时染表面蛋白？

A 我们建议表面蛋白染色与胞内磷酸化蛋白染色一起进行，但是需要评估并使用可识别固定表位的表面蛋白的抗体克隆，我们测试了很多表面蛋白抗体克隆性能，点击了解更多信息。 

表面和胞内蛋白分开染色时需注意选择耐甲醇荧光染料偶联的表面蛋白一抗，如FITC，Alexa fluor或eFluor系列染料偶联的抗体。

参考文献：

[1]Ardito, F., Giuliani, M., Perrone, D., Troiano, G., & Lo Muzio, L. (2017). The crucial role of protein phosphorylation in cell signaling and its use as targeted therapy. International journal of molecular medicine, 40(2), 271-280. 

[2]Toney, N. J., Schlom, J., & Donahue, R. N. (2023). Phosphoflow cytometry to assess cytokine signaling pathways in peripheral immune cells: potential for inferring immune cell function and treatment response in patients with solid tumors. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 42(1), 247. 

[3]https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/antibodies-for-flow-cytometry/phospho-specific-antibodies-flow-cytometry.html