T细胞激活的秘籍，流式必看！

T细胞激活是体外获取大量T淋巴细胞基础的实验手段之一，激活和扩增获得的T细胞可广泛应用于下游CAR-T、TCR-T等研究和治疗。生理状态下，TCR（T细胞受体）会与CD3γ, ε, σ和ζ形成一个大的复合物 (图1)。发生抗原提呈时，此复合物可能发生聚集、排阻去磷酸化的分子 、募集Lck（淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶）以及释放出包埋在膜内的CD3ζ分子等，进而刺激T细胞活化和增殖。

图1. T 细胞信号转导的正向调节^[1]

由于CD3ε亚基在T细胞表面相对容易被抗体识别和结合，因此商品化的T细胞激活抗体大多是针对CD3ε亚基的。与抗原提呈过程类似，在体外实验中，使用CD3ε的抗体，可以有效地模拟抗原-MHC复合物与TCR的结合，从而激活下游的信号传导通路。

除了CD3构象改变引起的第一信号，T细胞的完全活化还需要另一个共刺激信号（CD28介导的第二信号）。它通常与抗原提呈细胞表面的CD80/CD86分子作用，当然也可以用CD28抗体代替CD80/CD86来诱发第二信号。

图2. T 细胞刺激^[2]

CD3/CD28抗体活化T细胞操作步骤

这里以激活小鼠脾脏淋巴细胞为例

步骤 I：抗体包被96孔板

1. 在无菌 PBS 中制备 5-10 µg/mL anti-CD3（货号#16-0031-82）溶液。Note：建议进行预实验，以确定其他浓度CD3抗体诱导细胞活化的功效。
2. 将 50 µL 抗体溶液分配到96 孔板各孔中。对于未刺激的对照孔，添加 50 µL 无菌 PBS。
3. 封口膜密封96孔板以避免液体蒸发，37°C下孵育2 h，或提前一天准备并在 4°C 下保存过夜。
4. 添加细胞之前，取出50 µL抗体溶液。
5. 用 200 µL 无菌 PBS 冲洗每个孔并丢弃 PBS。
6. 重复上述步骤。

步骤 II：添加细胞

1. 将准备好的细胞用完全培养基重悬为1-2×10⁶/mL。Note：建议滴定细胞密度（2-3×10⁶细胞/mL至10⁵细胞/mL）以实现最佳活化。
2. 用 PBS 清洗孔后（上述步骤 6），向每个孔中添加 100 µL 细胞悬浮液（不同条件注意设置复孔）。
3. 添加CD28抗体（货号#16-0281-82），使其终浓度为 2 ug/mL。
4. 放入 37°C、5% CO₂ 培养箱中，孵育 2-4天。Note：孵育时间需要根据实验需求进行优化，注意观察细胞状态和培养基颜色，及时更换新鲜培养基。
5. 收获和处理细胞进行下游检测。

Question & Answer

Q 上述抗体刺激方案可以将T细胞扩增多少倍？

A 一般来讲，至少几十倍的扩增倍数是可以实现的。但这同时也与细胞来源、状态，以及抗体浓度和激活时间息息相关。

Q 抗原提呈的方法与用CD3/CD28抗体活化有什么区别？

A 利用抗原提呈方法活化的T细胞是某个抗原特异性的细胞，这部分细胞比例偏低，而CD3/CD28活化的T细胞是多克隆的，从而能够获得较多的T细胞。

Q 在什么时间该给T细胞进行补液或者换液呢？

A 激活过程中，需每天观察细胞是否形成克隆团。可以对细胞进行计数，如果出现培养基变黄或细胞密度过高的情况，可吹散细胞克隆团后调整细胞密度至0.5-1×10⁶/ml，离心重悬在新鲜培养基中。

Q 如果我需要观察T细胞增殖能力，有哪些方案呢？

A 可以采用细胞计数的方法，也可以利用染料稀释法观察T细胞的增殖代数，推荐使用CellTrace细胞增殖检测试剂（例如Celltrace CFSE，货号C34554），此外利用Click-it EdU的方法也可以检测不同刺激条件下T细胞的增殖能力。

Q CD3/CD28磁珠激活与CD3/CD28抗体激活T细胞有什么区别？

A 磁珠提供了多价交联信号，通常激活强度较高且持续时间较长，能够更有效地模拟天然APC的作用，但价格较高，常用于需要高效激活T细胞的实验；抗体激活的操作相对简单，激活强度和持续时间可能相对较弱，适用于一般的T细胞激活实验。

其他可参考的T细胞刺激活化方法^[3]

*ConA和PHA 作用机制类似，两者可以结合细胞膜蛋白上的糖基基团，诱发T细胞受体的交联，从而激活T细胞。

*辅助细胞：与APC细胞功能类似，为T细胞激活提供共刺激分子或者Fc受体（可提供抗体结合位点）。细胞来源可以是删除或未删除T细胞的其他免疫细胞组分。为避免辅助细胞的背景增殖，可以用细胞色素C或者γ射线进行处理。

参考文献：

[1] K Shah, K., Al-Haidari, A., Sun, J., & Kazi, J. U. (2021). T cell receptor (TCR) signaling in health and disease. Signal transduction and targeted therapy, 6(1), 412. doi: 10.1038/s41392-021-00823-w.

[2] Cappell, K. M., & Kochenderfer, J. N. (2021). A comparison of chimeric antigen receptors containing CD28 versus 4-1BB costimulatory domains. Nature reviews Clinical oncology, 18(11), 715-727. doi: 10.1038/s41571-021-00530-z

[3] Kruisbeek, A. M., Shevach, E., & Thornton, A. M. (2004). Proliferative Assays for T Cell Function. Current Protocols in Immunology. doi:10.1002/0471142735.im0312s60