成功qPCR实验的十个技巧

1. 高质量RNA

降解或不纯的RNA会限制逆转录反应的效率并降低产量。

降解或不纯的RNA会限制逆转录反应的效率并降低产量。RNA应从新鲜组织中制备，或使用如Invitrogen™ RNAlater®稳定液处理的组织中制备。因此，部分RNA降解是可以容忍的。如果无法使用完全完整的RNA，请设计引物使其与目标基因的内部区域结合。请注意，对于真正的定量RT-PCR，部分降解的RNA可能无法准确反映基因表达情况。

2. 良好的引物和探针设计

为了最有效地设计实时PCR用的引物和探针组合，我们强烈建议使用引物设计软件。大多数引物设计程序都包含可调参数，以实现最佳引物和探针设计。这些参数考虑了引物/探针Tm、互补性、二级结构，以及扩增片段大小等其他重要因素。同时建议限制相同核苷酸连续出现的数量。在为真核生物目标设计扩增片段时，应选择跨越目标mRNA至少一个外显子-外显子连接处的PCR引物，以防止来自污染基因组DNA的目标扩增。

如果你想完全避免设计的工作，可以选择预先设计好的 Applied Biosystems™ TaqMan® 检测试剂。每个检测试剂都包含所需的一切——目标引物和优化的序列特异性探针——无需额外设计、优化或冗长的熔解曲线分析。

3. 使用 Master Mix（主混合液）

主混合液将所有 qPCR 试剂混合在一起，有助于减少样品间和孔间的差异，并提高重复性。为了进一步减少孔间差异，请使用含有参考染料（如 ROX）的主混合液。请参考这个实用的选择指南来为你的实验选择合适的主混合液（你甚至可以获得一个免费样品）。

4. 避免交叉污染

PCR区域内的所有表面都应定期去污，以防止交叉污染。建议使用DNA去污溶液，如Invitrogen™ DNAzap™ PCR DNA降解溶液，该溶液能够破坏DNA。应运行一个“无模板对照”（NTC），以排除试剂和表面的交叉污染。NTC包含所有RT-PCR试剂除了 核酸模板。通常，DNA或RNA只需用无核酸酶水替代。在NTC中不应合成任何产物；如果扩增出产物，则说明一个或多个RT-PCR试剂被扩增子污染了。

如需了解更多信息，请阅读这篇关于在qPCR实验中避免污染的良好实验室规范的文章。

5. 使用“无逆转录酶”对照（No RT Control）

乎不可能完全消除RNA制备中的基因组DNA。因此，在qPCR实验中加入一个减去逆转录酶对照（“无扩增对照”或NAC）非常重要。通常，NAC是一个模拟逆转录反应，包含所有试剂，除了逆转录酶。如果在NAC中观察到产物，这很可能表明样品中存在污染的DNA。

一个更简单的解决方案是使用跨越外显子-外显子连接位点的检测方法。通过利用这种只存在于RNA（或cDNA）中的独特序列，就不会检测到基因组DNA。在查找预设计TaqMan检测试剂时，您可以筛选那些不会检测基因组DNA的试剂。

6. 使用合适的归一化对照

通过在实验中加入一个不变的内源性对照，可以提高任何qPCR实验的可靠性，以校正样品间的差异。一个好的对照其表达水平在所分析样品之间不应有变化。18S rRNA常被用作对照，因为其表达水平比其他传统内参如β-肌动蛋白或GAPDH更为稳定。如需了解更多关于选择内源性对照的信息，请下载此份应用说明。

7. 使用 SYBR® Green 进行解离（熔解）曲线分析

理想情况下，实验样品在扩增子熔解温度处应产生一个尖锐的峰值（一阶导数图），而 NAC 和 NTC 不会产生显著的荧光信号。该结果表明产物具有特异性，并且SYBR Green荧光是目标产物积累的直接测量指标。如果解离曲线显示一系列峰值，则说明对特异性和非特异性反应产物的区分不够。为了获得有意义的数据，需要进行优化。

使用 TaqMan 检测试剂避免优化和熔解曲线分析的必要性。预设计、基于探针的 TaqMan 检测试剂 不仅为您进行了优化，还提供了性能保证。

8. 正确设置基线和阈值

为了获得准确的 Ct 值，基线需要比最丰富样品的 Ct 值提前两个循环设置。要使实时 PCR 数据有意义，阈值应在产物处于指数增长阶段时设定。新的 Applied Biosystems 仪器和 Thermo Fisher Connect（云端）都具备自动设置基线和阈值的算法。一种名为相对阈值或 C 的新算法RT可以用于确定Cq。请查阅应用说明，C_RT，一种用于qPCR数据分析的相对阈值方法…，以获取更多信息。

快速回顾：相对阈值（Crt）方法。

下图和步骤描述了如何计算Crt。扩增曲线为蓝色；反应效率曲线模型为红色；左侧y轴对应蓝色扩增曲线，右侧y轴对应红色曲线。Crt的确定分为四个步骤：
使用预设的内部参考效率水平（粉色虚线）来识别反应效率曲线（模型）达到特定数值时的小数周期（Ce）。

1. 使用预设的内部参考效率水平（粉色虚线）来确定反应效率曲线（模型）达到特定值时的分数周期（Ce）。
2. 荧光水平（Fe）对应于扩增曲线上的分数循环Ce。
3. 相对荧光阈值（浅蓝色虚线）是根据Fe的特定百分比（%Fe）计算得出的曲线特异性阈值。
4. Crt被计算为扩增曲线与相对荧光阈值交叉时的分数循环。

9. 确认反应效率

反应的效率（Eff）可通过以下公式计算：

PCR的效率应为90–110%（3.6 > 斜率 > 3.1）。多种变量会影响PCR的效率，包括扩增子长度、二级结构和引物设计等。虽然可以获得落在该效率范围之外的有效数据，但仍建议进一步优化qPCR，或设计替代扩增子。

10. 使用适当范围的标准曲线

对于RNA定量（绝对或相对定量）研究中的每个基因，或用于比较定量（delta-delta-Ct）中验证反应效率，应分别制备标准曲线。标准曲线应覆盖目标预期丰度以上和以下的范围。还可以包括其他输入量，如高于和低于检测限的最小和最大RNA用量，以帮助区分特异性产物和非特异性产物。

仅供科研使用。不用于诊断程序。