ROX参比染料在qPCR中的作用

尽管现代方法简化了qPCR的设置和执行，有时仍会出现问题，结果也未必如预期。在赛默飞世尔科技，我们尽可能减少qPCR中的猜测，使数据质量得到提升，让qPCR变得更简单、更具信息性。为此，Applied Biosystems™ 提供qPCR预混液其中包含ROX™参比染料，有助于提高技术重复之间的精确度，并为故障排查提供关键见解。

什么是ROX染料？

ROX染料是一种惰性荧光染料，可以作为qPCR预混液的组成部分添加。与SYBR™ Green或FAM™染料等报告染料不同，ROX染料的荧光不会受到PCR产物扩增的影响。然而，ROX荧光会受到任何能改变整体荧光读数因素的影响，例如：

• 孔中气泡
• 蒸发
• 冷凝或水滴
• 仪器问题，如电涌

这使得ROX染料能够作为被动参比染料，用于荧光定量PCR数据的荧光归一化。为了计算归一化值（Rn），需要将报告染料的信号除以ROX参比染料的信号。只要ROX染料与报告染料之间的比例保持不变，ROX染料就能帮助校正许多可能导致扩增读数偏差的变量。

在左侧的扩增曲线示例中，可以看到孔中的气泡如何影响荧光读数。然而，在右侧的扩增曲线中，我们使用ROX染料作为被动参考对数据进行了归一化，并消除了因气泡引起的异常情况。

未进行ROX染料归一化时孔中的气泡

进行ROX染料归一化时孔中的气泡

为什么在qPCR中使用ROX染料？

ROX染料提高技术重复实验的精确度各个孔之间出现轻微差异是常见现象，当使用qPCR 检测虽然不是必需的，但使用像ROX染料这样的被动参考来归一化数据，有助于在技术重复之间实现更高水平的精确度。如果不进行归一化，可能需要更多的重复实验才能达到相同的精确度，从而增加每次运行所需的时间和资源。用ROX染料归一化的数据比未归一化的数据更加精确，使研究人员能够减少重复次数，同时保持统计效力。

在这些cDNA稀释系列的扩增曲线示例中，你可以看到使用ROX染料归一化如何缩小标准差，即技术重复的精确度。

未使用ROX染料归一化（标准差 = 0.028）

使用ROX染料归一化（标准差 = 0.01）

ROX染料有助于排查常见qPCR问题ROX染料也是检测最简单人为错误的一种方法：忘记在反应中加入扩增模板——也就是被测量的核酸。有位研究人员向我们讲述了一个难忘的故事，他在培训朋友做qPCR时给出的指令是：“只要把主混合液、试剂、模板和水加到管里。明天我们看看扩增效果。”反应失败后，故障排查揭示了问题所在。“我能在多组分图中看到FAM染料，这说明试剂已经加进去了。我能看到ROX染料，这说明主混合液也加进去了。我看到孔里有足够体积，看起来水也加进去了。我告诉她唯一无法确认的是模板。”此时，研究员的朋友尴尬地承认：“我不知道你说的模板是什么意思。”

如何利用ROX参比染料排查qPCR故障？

在多组分图中监测ROX荧光，可以帮助研究人员发现qPCR运行中的各种质量控制问题。排查您的数据使用多组分图，检查ROX染料信号的形状：

ROX染料读数在整个实验过程中保持平稳——这是预期结果。ROX荧光应在反应期间保持恒定，因为它不受扩增影响，如本例中的多组分图所示。
ROX染料读数在实验过程中增加——这表明正在发生蒸发现象。
ROX染料读数瞬间出现尖峰或下降——这表示仪器记录该孔数据时受到突发变化干扰，例如气泡或电涌。

同样有用的是，ROX染料不会受到其他类型错误的影响，比如引物降解或引物二聚体形成，有助于区分这些问题与设备或染料相关的问题。

因此，ROX染料是一种低成本工具，可用于诊断qPCR实验中的问题并对数据进行归一化，使其更加精确。目前市场上的许多qPCR预混液已经包含了ROX染料，因此使用它无需额外操作。此外，qPCR软件可以自动处理ROX染料对实验数据的贡献，为研究人员节省分析结果的时间。Applied Biosystems™ qPCR 反应混合液和QuantStudio 实时 PCR 系统在 qPCR 实验的所有阶段都预先配备了 ROX 染料，帮助研究人员获得最佳的数据结果。然而，对于希望在多重检测开发中拥有更大灵活性的研究人员来说，还可以选择第二种被动参比染料 Mustang Purple。

观看: ROX 染料在qPCR 中的作用

阅读: 用于排查qPCR 的 ROX 被动参比染料应用说明

仅供科研使用。不得用于诊断程序。