流式细胞术检测细胞核内的蛋白靶标

使用流式细胞术检测细胞核内的蛋白靶标是非常强大的生物学研究方法，对于解码细胞生命过程起着关键作用。它就像是打开细胞生命奥秘的钥匙，直抵基因表达和调控的秘密花园，助力揭示信号传导的核心机制，引导科学家们深入解读疾病发生和新药评估。

图1. 炎症中NF-κB信号通路^[1]

设想一下，我们要开启一扇通向细胞核内部的大门，细胞核内流式染色的抗体就像探险队员一样，必须穿过层层关卡，这里既有遮蔽世界的细胞膜，又有保护核心的细胞核膜。在此处，必须要有神奇宝物的加持！既要维持细胞完整性，又要解锁细胞并打开细胞核的大门让抗体轻松进入，这就是今日主角——Invitrogen eBioscience Foxp3/转录因子流式固定破膜缓冲液（货号00-5523-00）。

试剂配置

将1份固定/破膜浓缩液(4X)与3份固定/破膜稀释液混合，制备新鲜的固定/破膜工作液；
将1份破膜缓冲液 (10X)与9份蒸馏水混合，制备1X破膜工作液。

实验步骤

使用00-5523-00，可以一步完成固定和破膜，不仅可以检测核内抗原，还可同时检测多种细胞因子、趋化因子。我们已经研究了00-5523-00对于不同的细胞因子的兼容性，点击了解更多信息。如果待测细胞因子不在表格中，建议参考文献或者做预实验来确定是否兼容。

本实验方案是以1.5mL EP管染色为例

制备单细胞悬液，将准备好的10^6个细胞置于100 μL PBS中。
[可选] 根据样本种属及来源选择合适的Fc受体封闭剂。点击实验步骤最后的往期内容：封闭Fc受体，了解更多详情。
[可选] 使用可固定细胞活性染料对细胞进行染色：使用1 mL PBS重悬细胞，向其中加入1 μL可固定死活染料，混合均匀后4°C避光孵育30 分钟。
[可选] 对细胞表面标志物进行染色：使用Staining Buffer配制表面抗体预混液，每个样本需要50 μL的抗体预混液，使染色体系总体积约为100 μL，轻轻地脉冲涡旋混合，4°C避光孵育30 分钟。点击实验步骤最后的往期内容：细胞表面流式染色，了解更多详情。
清洗两次，最后一次洗涤后，弃上清并脉冲涡旋样品以完全离解细胞团块，通常保留约100 μL残余体积。
加1 mL 固定/破膜工作液并涡旋混匀。
2-8°C或室温避光孵育30-60分钟。（小鼠样品可在 2-8°C遮光孵育长达18小时）。室温400-600 x g离心5分钟，弃上清。
加入1 mL 1X破膜工作液。室温400-600 x g离心5分钟，弃上清。
[可选] 重复上一步。
剩余100 μL的1X破膜工作液重悬细胞。
[可选] 向细胞中加入2 μL 2％正常小鼠/大鼠血清封闭，室温孵育15分钟。
直接加入推荐量的荧光偶联的流式抗体，室温避光孵育至少30分钟。
加入1 mL 1X破膜工作液。室温400-600 x g离心5分钟。
弃上清，重复上一步。
将染色后的细胞重悬于适当体积的流式细胞染色液中，上机检测。
结果分析：通过流式细胞术圈门规则，分析蛋白表达情况。

本实验方案适用于在单细胞水平上同时检测细胞表面抗原、胞内及核内抗原。细胞核内染色也可通过流式管染色或96孔板染色的方式进行，查看详细实验步骤。

数据展示

选择正确的固定透化缓冲液，是实验成功的基础。我们测试了eBioscience™ Foxp3/转录因子流式固定破膜缓冲液（货号00-5523-00）和eBioscience™ 流式胞内固定破膜缓冲液（货号88-8824-00）对Foxp3的检测效果，结果显示使用00-5523-00处理细胞能较好识别Foxp3信号，同时该处理方法兼容IFNγ检测^[2]。