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设计有效的CRISPR实验包含多个步骤，其中之一就是高效设计单导向RNA（sgRNA）。sgRNA是可以编程的序列，能够引导核酸酶（如CRISPR-Cas9）靶向特定的DNA序列。高效的sgRNA设计对于开展精确的基因组编辑实验至关重要。

选择 gRNA 形式

为什么sgRNA设计很重要？

为了优化sgRNA的设计，应考虑以下因素：

  1. PAM兼容性：原间隔序列邻近基序（PAM）是Cas蛋白识别、结合目标DNA并启动切割过程所必需的。不同的Cas蛋白变体识别不同的PAM序列（例如Cas9识别NGG）。请务必确认您的目标位点包含兼容的PAM序列。如果目标位点缺少所需的PAM序列，可以考虑使用TALENs来实现您的编辑目的。TrueDesign基因组编辑器还可以为感兴趣区域设计TALEN配对。
  2. 靶上活性：sgRNA的有效性由其序列、周围DNA环境以及其他特征（如sgRNA:DNA解链温度、折叠spacer序列的最小自由能以及染色质可及性）决定。研究人员已利用这些因素开发出多种机器学习算法，用于预测sgRNA的靶上活性。在设计靶向特定区域的sgRNA时，预测的靶上活性评分可以帮助用户选择最佳的sgRNA。在TrueDesign基因组编辑器中，我们采用Rule Set 3 [1] 来确定靶上评分。
  3. 脱靶活性：在设计sgRNA的过程中，也应评估其脱靶特征。这包括扫描目标基因组中具有序列相似性的区域。脱靶搜索应考虑到错配情况，因为像Cas9这样的核酸酶能够使sgRNA即使存在错配也能结合，从而导致非预期的编辑结果。此外，Cas9还能识别替代性的PAM序列，如NAG和NGA，这些也应该包含在脱靶分析中，以全面评估潜在的脱靶效应。TrueDesign基因组编辑器通过允许sgRNA序列最多有3个错配来评估脱靶位点，并且包括具有NGG、NGA和NAG PAM序列的位点。TrueDesign基因组编辑器使用切割频率决定（CFD）评分[2]对脱靶位点进行评分，并标注脱靶位点的位置，表明该位点是在基因的外显子还是内含子中，以及该基因是否是癌基因或抑癌基因。这些详细信息可以帮助用户选择脱靶位点数量少的sgRNA、脱靶位点CFD评分低的sgRNA、脱靶位点位于内含子或基因间区的sgRNA，或者综合考虑这些因素。
  4. 与编辑位点的距离：目标序列与所需编辑位点之间的距离灵活性取决于实验类型。对于敲除实验，sgRNA应理想地设计为靶向外显子早期的序列。对于敲入实验，sgRNA应设计为尽可能接近所需的插入位点。除了sgRNA活性之外，敲入效率还取决于敲入片段的长度以及插入位点与sgRNA切割位点之间的距离。对于具有较短同源臂的插入序列，如果sgRNA切割位点距离插入位点超过10 bp，则敲入效率较低。然而，对于具有较长同源臂的序列，即使切割位点距离所需插入位点达40 bp，也可以实现较高的敲入效率。
  5. 变异重叠：使用参考基因组设计的sgRNA可能会由于遗传变异的存在而导致效率和特异性降低。遗传变异可能导致PAM位点的破坏、新PAM位点的产生或在目标序列中引入错配。因此，在设计sgRNA时，考虑特定目标人群（如果已知）或总体人群中的遗传变异是非常重要的。TrueDesign基因组编辑器使得在引导RNA设计过程中可以轻松可视化遗传变异，并允许用户执行包含遗传变异的脱靶搜索。
基于IPS的优化sgRNA设计图

验证sgRNA设计

虽然可以使用多种算法来设计和选择最佳的引导RNA，但最终验证它们的方法是对其进行功能测试。算法设计用于预测，但细胞环境和递送方法等因素可能会显著影响sgRNA的效率。我们建议对您的sgRNA进行功能性测试。

验证是确保sgRNA功能性的关键。在测量sgRNA效率时，拥有适当的阳性、阴性和递送对照至关重要。sgRNA的效率可以通过多种方式进行测量：

  1. 基于T7核酸酶的检测：Invitrogen GeneArt基因组切割检测（GCD）试剂盒可用于快速且可靠地确认您sgRNA的编辑效率。TrueDesign基因组编辑器为所选sgRNA设计GCD引物。
  2. 测序：Sanger测序或高通量测序可用于确定sgRNA的效率以及目标区域编辑的性质。插入或缺失引起的移码突变或剪接位点破坏可能导致基因敲除。如果进行了敲入实验，测序可以确认预期模板是否成功插入到目标位置。TrueDesign基因组编辑器还提供针对编辑位点测序的引物设计。
  3. 流式细胞术：可以使用荧光标记的抗体或报告基因来验证sgRNA在细胞中的编辑效率，这些细胞由于基因组编辑而预期会出现特定的表型变化。

结论

设计和验证有效的sgRNA对于开展准确且高效的CRISPR实验至关重要。遵循建议的sgRNA设计原则和验证步骤有助于确保生成高效的sgRNA。为了简化sgRNA的设计，Thermo Fisher Scientific提供了一个免费平台，用于构建sgRNA和基因编辑实验——TrueDesign基因组编辑器。该基因组编辑设计工具整合了推荐的sgRNA设计优化原则，并提供脱靶效应评估和验证支持，使研究人员能够精确且便捷地构建sgRNA。访问https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home/life-science/genome-editing/geneart-crispr/invitrogen-truedesign-genome-editor.html了解更多信息。要观看有关如何使用TrueDesign基因组编辑器的视频，请在此处查看播放列表。

仅供研究使用，不可用于诊断程序。

参考文献

  • [1] DeWeirdt, P. C. 等人. (2022). 考虑tracrRNA序列的小幅变异可改善CRISPR筛选中sgRNA活性的预测。*Nature Biotechnology, 40*(4), 570-578.https://doi.org/10.1038/s41587-021-01107-5
  • [2] Doench, J. G. 等人. (2016). 优化sgRNA设计以最大化CRISPR-Cas9的活性并最小化脱靶效应。*Nature Biotechnology, 34*(2), 184-191.https://doi.org/10.1038/nbt.3437