PCR克隆支持 – 问题排查

在-80摄氏度下储存是可以的。TOPO载体可以多次反复冻融而不失活，而且载体在-20摄氏度或者-80摄氏度下储存均能保持稳定性。但是需要注意的是载体在室温下会快速失活（约15分钟），这会导致较低的克隆效率（转化后生长的克隆数会降低）。所以在使用过程中要将其放置在冰浴上以防活性降低，用完后快速放回冰箱。

很遗憾，不可以。电转感受态细胞没有经过化学处理。不像化学感受态细胞，电转感受态细胞有完整的细胞膜。

为了提高凝胶中结晶紫染色的强度，请将凝胶置于结晶紫染色液（将45 µL浓度为2 mg/mL染色剂加入到100 mL无菌水中或在0.1X TAE中加入1-10 µg/mL染色剂）中数小时，染色会加深一些。切胶时为了看得更清晰可以把凝胶放在白色背景下。

pCR™II和pCR™2.1载体两端为回文序列，因为两端都必须容纳TOPO结合位点。所以一旦载体连接后，由于载体的序列是有可能形成二级结构的。这通常并不会影响测序或者PCR结果，因为PCR循环条件通常足以克服可能形成的二级结构。但是，某些插入片段可能通过克隆位点两侧的区域而提高形成此类二级结构的可能性。强二级结构可能抑制通常用于自动化测序的循环测序反应。如果您怀疑您的克隆存在此问题，您可以尝试下述措施：

1. 提高循环的退火温度，甚或尝试两步式循环反应。
2. 向反应中加入DMSO。这可能降低二级结构的形成。但是，当心这同样可能影响荧光值或反应体系中的其它组分。
3. 设计位于插入片段内部的引物。
4. 最后的措施：改用非循环条件，例如使用测序酶、S-35标记的dNTPs进行手动测序。这可能是最不方便但最有效的方法。

请尝试以下建议以提高克隆数量。

• 向反应中加入6X盐溶液后，提高TOPO反应在室温孵育的时间。
• 电转化能显著提高克隆数量；通常能提高10到20倍。但是，如果进行电转化，重要的一点是TOPO反应混合物要包含稀释的盐溶液，或者，为获得最佳结果，在转化前进行沉淀。为获得高电转化效率，建议如下操作：
  • 向 6 µL TOPO反应体系中加入100 µL双蒸水并在37度再孵育10分钟。
  • 加入10 µL 3 M 醋酸钠，2 µL 20 µg/µL糖原，300 µL 100%乙醇进行沉淀。置于干冰上或–80摄氏度20分钟，4摄氏度最高速离心15分钟。使用800 µL 80%乙醇洗涤沉淀团块，最高速离心10分钟，倒去乙醇，离心1分钟，然后移除剩余乙醇，避免碰到沉淀团块。干燥沉淀团块（空气干燥或真空吸干）。
  • 将沉淀重悬于10 µL ddH2O中并根据常用电转步骤使用3.3 µL 重悬的DNA进行电转化。该电转化将产生比使用同样的TOPO-反应体系进行化学转化时多出高达20倍的克隆。加入100 µL ddH2O并孵育10分钟并不是绝对必要，但是它能充分的稀释反应并可能有助于拓扑异构酶的失活，以使得电转化更容易进行。

这里是一些提高定向TOPO克隆反应效率的建议：

• 确保 5’引物带有–CACC而3’引物不含有类似于GTGG的序列。 to GTGG.
• PCR产物：TOPO载体的摩尔比是成功的关键。我们建议使用1:1到2:1的摩尔比，从PCR产物：TOPO载体比值为1:1开始。当PCR产物：TOPO载体的摩尔比<0.1:1或>5:1时TOPO克隆效率将显著下降。这些结果通常是由于在TOPO克隆反应中使用了太少的PCR产物（例如PCR产物稀释过多）或者使用了过多的PCR产物造成的。如果对PCR产物的产量进行了定量，那么可能需要在进行TOPO克隆前对PCR产物浓度进行调整。对于pENTR™ TOPO载体而言，在TOPO克隆反应中使用1-5 ng的1 kb PCR产物或5-10 ng的2 kb PCR产物通常会得到较多数量的克隆。

请考虑以下可能原因：

• pH > 9：检查PCR扩增反应的pH值，并使用1 M Tris-HCl, pH 8的缓冲液进行调节。
• PCR产物过多（或过度稀释）：减少PCR产物的用量（或增加其浓度)
• PCR反应延伸不完全：确保PCR反应最后包含一个7到30分钟的延伸步骤。长的PCR产物将需要更长的延伸时间。
• 克隆长插入片段（>1 kb）：请尝试以下一个或全部建议：提高插入片段用量。延长 TOPO克隆反应孵育时间。使用硅基DNA纯化系统（如PureLink系统）或者电洗脱法对插入片段进行凝胶纯化。确保所有溶液均不含核酸酶（例如避免共用溴化乙锭染色器皿）。
• 尽管你使用了Taq聚合酶但是PCR产物仍然没有足够的3´ A突出：提高最后的延伸时间以确保所有的3´末端被腺苷化。Taq聚合酶在模板链的A后面再添加一个A时的效率较低。Taq聚合酶在模板链的C后边添加一个A时的效率最高。您可能需要重新设计引物以使它们包含一个5´ G而非一个5´ T。

无克隆产生的原因可能是出现了下列问题：

• 细菌不是感受态细胞。使用包含在One Shot模块内的pUC18载体检查感受态细胞的转化效率。
• 平板的抗生素浓度不正确，或者平板过于陈旧。使用100 μg/mL的氨苄青霉素或50 µg/mL的卡那霉素。确保氨苄平板是新鲜的（储存时间小于1个月）。
• 产物被磷酸化了（仅针对TOPO克隆而言）。磷酸化的产物可以进行TA-克隆但不能进行TOPO-克隆。这是因为连接所需的磷酸基团已经包含在载体DNA和拓扑异构酶-形成的中间体复合物中了。TOPO载体含有一个与拓扑异构酶共价结合的3' 磷酸基团和一个5'磷酸基团。非TOPO载体（TA和Blunt）含有一个3' OH基团和一个5'磷酸基团。磷酸化产物在进行TOPO-克隆之前应该用磷酸酶（CIP）处理。

出现这一问题的原因可能有：

• 插入片段没有破坏lacZ基因的读码框。如果你的插入序列较短（< 500 bp），则可能出现浅蓝色克隆。可以分析一些这类克隆，因为它们可能含有插入片段。
• 使用了不能在3´ 末端加A的聚合酶。如果您使用的是具有校读活性的聚合酶，例如AccuPrime™ Pfx 或Platinum Pfx™，您将需要进行一个后续Taq酶处理步骤以添加3’ A突出末端。
• PCR产物在连接之前进行了凝胶纯化。凝胶纯化可以去除单个的3’ A突出碱基。如果没有进行凝胶纯化，那么请优化您的PCR反应以便可以直接从PCR产物进入克隆步骤。
• PCR产物在进行连接反应前被存放了很长时间。请使用新鲜PCR产物。即使仅存放1天，连接效率也会下降。
• 连接反应中加入了太多扩增反应的成分。PCR反应体系内的高盐成分会抑制连接反应。在连接反应中应使用不超过2-3 μl的PCR反应混合物。
• 连接反应中的载体：插入片段摩尔比可能不正确。估计PCR产物的浓度。使连接反应中载体和插入片段的摩尔比大约为1:1或1:3。

通常平板上应该有少量不含插入片段的白色克隆。这些克隆通常比其它克隆大一些，是由于罕见的重组事件会导致质粒上部分序列缺失引起的（通常是从多克隆接头到F1起始点附近的一个位点）。为找到含有插入片段的克隆，最好挑选各种颜色和形态的克隆进行分析。同一插入片段经常会由于插入方向的不同而产生两种完全不同的克隆形态。

你可能克隆了一段假阳性序列。TA和TOPO克隆对于存在于某些PCR反应中的小片段（< 100 bp）非常高效。使用硅基DNA纯化系统对插入片段进行凝胶纯化或者电洗脱。确保所有溶液均不含核酸酶（例如避免共用溴化乙锭染色器皿）。

如果插入片段对于宿主细胞可能具有毒性，那么这里有一些建议您可以进行尝试：

• 在转化TOP10或DH5α细胞后，在25-30摄氏度而非37摄氏度进行孵育。这将降低生长速度并提高可能具有毒性的片段的克隆成功机率。
• 试试使用TOP10F’细胞进行转化，但是不要在平板内加入IPTG。这些细胞带有 lacIq抑制子，它会抑制lac启动子介导的表达，从而使得毒性基因可以被克隆。需要记住的是在没有IPTG时，不能进行蓝白斑筛选。
• 试试使用Stbl2细胞进行转化。

这里有一些可能的原因和建议：

• 不正确的PCR引物设计：确保正向PCR引物在5′末端包含CACC序列。CACC序列和定向TOPO载体上的突出序列GTGG互补。
• 反向PCR引物和5’末端的GTGG突出序列互补：确保反向引物在5′末端不包含CACC序列。
• 正向插入的目的片段可能具有毒性，从而导致仅有反向插入的目的片段的克隆：在转化胞后，将细胞在25-30摄氏度而非37摄氏度进行孵育。这将降低生长速度并提高可能具有毒性的片段的克隆成功机率
• 试试使用TOP10F’细胞进行转化，但是不要在平板内加入IPTG。这些细胞带有 lacIq抑制子，它会抑制lac启动子介导的表达，从而使得毒性基因可以被克隆。需要记住的是在没有IPTG时，不能进行蓝白斑筛选。
• 试试使用Stbl2细胞进行转化。

磷酸化的产物可以进行TA克隆但不能进行TOPO克隆。这是因为所需的磷酸基团已经包含在载体DNA和拓扑异构酶形成的中间体复合物中。TOPO载体含有一个与拓扑异构酶共价结合的3' 磷酸基团和一个5'磷酸基团。非TOPO载体的线性载体（TA和Blunt）含有一个3' OH基团和一个5'磷酸基团。磷酸化产物在进行TOPO-克隆之前应该用磷酸酶（CIP）处理。

仅使用载体进行转化不是推荐的阴性对照实验。拓扑异构酶改构过程不是一个效率100%的过程，因此，在您的混合物中将会存在“不含插入片段的载体”，因此会产生克隆。