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病毒学是微生物学领域,涉及病毒及其引起的疾病的研究。在全球的病毒研究实验室中,科研工作者们借助各种工具对病毒本身的结构、组成进行研究,并且深入研究病毒寄生的原理,寻求防控或治疗病毒引起的相关疾病的方法。
2020年2月15日,科技部社会发展科技司司长吴远彬在今天(15日)的国务院联防联控新闻发布会上介绍,为加强规范管理和服务,高效有序推进全国应急科技攻关,科技部出台了《关于加强新冠病毒高等级病毒微生物实验室生物安全管理的指导意见》。这也说明并非所有的生命科学实验室可以开展病毒研究。而是需要具备一定资质的实验室才能开展。目前,开展“新型冠状肺炎病毒”研究的实验室均有生物安全三级及以上的实验室。
生物安全防护实验室根据微生物及其毒素的危害程度不同而分级。从事致病性微生物实验的单位,作为各类传染病菌(毒)研究操作的基本单元,实验室必须有防止致病性微生物扩散的制度和人体防护措施;不同危害等级的微生物,必须在不同的物理性防护条件下操作,一方面防止实验人员和其他物品受污染,同时也防止其释放到环境中。
赛默飞是全球科学服务供应商,生产并提供一系列生物安全等级实验室所需的设备。一般情况下,开展病毒研究的生物安全实验室都会具备以下基本装置和设备:
纯水机
移液器与耗材
研磨仪
生物安全柜
液氮罐
超低温冰箱
培养箱
Gibco™ 细胞培养基,添加剂以及消化酶
Gibco™ 胎牛血清
Thermo Scientific 细胞培养塑料耗材
涡旋混合器
水浴锅
酶标仪
离心机
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离心机
自新冠肺炎疫情发生以来,科技部动员全国优势科研力量,围绕新冠肺炎的诊疗方案、有效药物筛选、病毒溯源和中西医结合等领域即时组织开展应急防控技术科研攻关,也取得了阶段性成果。此次研究,各部门都高效配合,研究速度都在提升。然而,科研没有捷径,无论是“新型冠状病毒”,还是其他类型的病毒,它的形态、寄生机制和防控方法都是科研工作者关心的。
世界卫生组织总干事谭德塞不止一次高度 评价中国此次抗击疫情的努力,其中很重要的 原因之一就是中国以前所未有的速度分离出病 毒,进行基因测序并立即同世卫组织分享。病 毒毒株的分离,是对病毒开展系列研究的重要前提。
有了毒株,才能促进快速检测试剂盒的开发,才能开展一系列实验去探寻病毒基因组复 制、基因表达及其调控机制,提示病毒感染、 致病的分子本质,为病毒基因工程疫苗和抗病 毒药物的研制以及病毒病的诊断,预防和治疗 提供理论基础和依据。
可以看到,针对病毒分子机制的研究涉及到分子生物学,细胞生物学,蛋白生物学等各个学科 的研究领域,且相互交叉。赛默飞针对病毒鉴定、病毒与细胞之间的免疫反应检测、细胞凋亡检测 和细胞信号传导部分都有相关的解决方案供选择。
Ion S5 高通量测序平台
荧光 PCR 检测平台
Thermo Scientific™ KingFisher Flex 是一款高通量自动化核酸提取仪器(具备NMPA,一类备案),适用于各类样本的核酸提取,能够提供更高效样品制备、更稳定的样品结果、更简单的样品分析。上市10年以来,从H1N1、SARS到H7N9、猪瘟,KingFisher始终坚守在重大疫情检测一线。
病微生物分子检测技术中最成熟、应用最为广泛的就是定量 PCR (RT-PCR) 技术,利用荧光标记的分子探针检测特定病原物的特征性序列位点,可以快速准确地实现感染样本筛查和病原物鉴定,操作简单,检测速度快,准确度高,成本低, 可以实现大量样本的快速准确筛查。
Thermo Fisher 旗下子品牌Applied Biosystems™设计生产的实时荧光定量 PCR 系统旨在提供高品质数据和卓越的可靠性,并提供智能工作流程体验,为您的实验室研究带来革新性 qPCR 检测平台。
Applied Biosystem 7500
十五年临床分子诊断全行业产品金标准,5色通道荧光检测, 新型光路设计,性能强大,结果稳定,模块化软件交互界面友好,反应设置快捷方便。临床绝大多数qPCR 检测试剂盒适配机型。
Applied Biosystem 7500 该款机型在临床市场上得到了高度的认可,而且该机型适配市场上绝大多数qPCR的IVD试剂盒。针对此次新冠状病毒的大多数试剂盒及目前所有获批的qPCR新冠状病毒检测试剂盒都可以在此款平台上面检测使用。
viewRNA 技术
ViewRNA Assay
ELISA
ProcartaPlex
流式检测仪
流式检测抗体试剂
细胞凋亡
自噬
细胞毒性活力代谢
基于LC3B和p62特异性追踪自噬过程:
蛋白制备 & 纯化
Western Blot
我们提供各种试剂盒、试剂和实验用小装置,您可以轻松提取、纯化、除杂(脱盐、透析)并浓缩靶标蛋白质。 这些产品经过优化适用于多种组织和细胞类型,针对不同“个性”的靶标蛋白,提供了更多的选择以确保更好的蛋白回收率和蛋白活性。
赛默飞 iWestern 流程旨在提升实验效率、提高数据重现性和结果可靠性,致力于以最少的手动操作时间实现卓越的免疫印迹结果。
借助我们的iWestern 工作流程,实验室中的生活将会变得更轻松、更省时,可以腾出时间专注于最重要的事情–数据分析,并对研究进行深入思考。
病毒主要由核酸和蛋白质组成,结构相对简单,然后要对病毒结构做综合研究,需要配合生物化学和分子生物学方法研究蛋白结构与功能,各个层次的生命活动,都需要在分子水平上进行物质结构和功能的研究才能最终阐明其本质。赛默飞利用其全球化资源优势,为病毒结构研究添砖加瓦。
Purelink病毒RNA/DNA小量提取试剂盒
TRIzol溶液
Qubit荧光计及试剂
Taq热启动DNA聚合酶
E-Gel PowerSnap核酸电泳
FastDigest快速内切酶
T4 DNA连接酶
Invitrogen感受态细胞
Purelink™ Expi无内毒素质粒大量提取试剂
精准核酸定量专为您的珍贵样品设计
Invitrogen Platinum Taq热启动DNA聚合酶上市二十多年来,已经被上千篇的文献引用。作为Platinum Taq热启动酶的升级版,新一代的Platinum II Taq热启动DNA聚合酶能让PCR扩增变得更快、更简单。
Expi293™ 蛋白表达系统
ExpiCHO™ 蛋白表达系统
ExpiSf™ 蛋白表达系统
Thermo Scientific™ Zeba™ 脱盐装置
Thermo Scientific™ Slide-A-Lyze™透析装置
蛋白纯化树脂
我们提供多种形式的蛋白质纯化和抗体纯化树脂,您可从中选出适合蛋白纯化实验流程的最佳方案。或者通过将特定配体共价交联到我们提供的活性介质上,获得您的定制化纯化树脂。
我们提供预先活化的磁珠、磁性琼脂糖微珠、标准品及Superflow琼脂糖树脂、POROS™ 树脂,以及其它色谱填料,可以进行几乎任何规模的蛋白质纯化:检测、筛选、小试、中试,以及工艺建立。
Invitrogen 蛋白电泳系统
高效全流程Western blot产品
赛默飞 iWestern 流程旨在提升实验效率、提高数据重现性和结果可靠性,致力于以最少的手动操作时间实现卓越的免疫印迹结果。
借助我们的iWestern 工作流程,实验室中的生活将会变得更轻松、更省时,可以腾出时间专注于最重要的事情 - 数据分析,并对研究进行深入思考。
Orbitrap 高分辨质谱
冷冻透射电镜
作为革命性全新一代组合型超高分辨质谱系统,Orbitrap Exploris™ 480质谱仪占用的空间更小,同时保持了高分辨率、高质量精度和图谱质量。新仪器具有很多新特性,可以延长正常运行时间,并在高通量分析试验中提高超强稳定性 。其结合成熟的技术,先进的功能和智能驱动分析框架为研究科学家更广泛应用质谱进行高通量的蛋白质鉴定、定量和结构表征。全新的SureQuant及BoxCar方法包为超敏感目标蛋白定量提供强大助力。其新增主要性能如下:
新一代Thermo Scientific Krios G4冷冻透射电镜(Cryo-TEM)使您能够在分子水平上更容易、更快、更可靠地揭示生命。最紧凑设计的Krios G4配备了高度稳定的300 kV TEM平台和行业领先的Autoloader设备,适应于冷冻电镜单颗粒分析(SPA)、冷冻电子断层扫描(cryo-tomography)和微电子衍射(MicroED),让每位用户包括新用户都能很容易得到最佳的实验结果。通过对机械底座框架和设备外壳的全新设计,该款设备净身高缩短至 3 m 以内,适用于任何天花板高度在 3.04 m(10 ft)以上的实验室,由此可省去昂贵的实验室改造费用。
核心优势
在电子显微镜下,新型冠状病毒的外膜上有明显的棒状粒子突起,呈球形或椭圆形,使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠,因此获名“冠状病毒”。
2020年2月15日,美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan教授团队和美国国立卫生研究院NIH联合在预印版网站bioRxiv上发表了首篇使用冷冻电镜解析新冠病毒S蛋白的研究文章。Jason Mclellan团队通过冷冻电镜Cryo-EM技术,解析了新冠病毒S蛋白三聚体的3.5Å的近原子分辨率结构,从生物物理及结构生物学的角度加深了我们对新冠病毒的认知。
奥斯汀分校的研究团队展示了新冠病毒的S 蛋白结构。然 而,ACE2 到底在细胞膜上是以什么状态存在?新冠病毒对比 SARS 病毒与ACE2 结合有何异同?获取ACE2 的全长蛋白及 其与S 蛋白的复合物结构,将有助于解答上述疑问。 2020 年 2 月19 日,西湖大学周强实验室利用冷冻电镜技术首次成功 解析此次新冠病毒的受体——ACE2 的全长结构。
图2. ACE2-B0AT1 复合物和之前解析复合物(SARS-CoV 的S 蛋白与ACE2 的PD 结 构域的复合物)的比较,两种复合物通过PD 结构域锚定在一起。(引用来源:https:// mp.weixin.qq.com/s/WoYgx3wejD9f9mSVj9q7KQ)
冷冻电镜工作流程:首先通过快速冲入式冷冻,在载网上形成一层薄的无定形冰,这个过程可 以将病毒蛋白或者受感染的细胞保存于接近天然状态的结构,然后在冷冻电镜上采集数据,最后通 过三维重构获得病毒近原子级分辨率的结构,甚至可以看到病毒和宿主细胞结合的过程,以了解其侵入机制,实现从结构到功能的飞跃,从而为未来抗病毒药物的开发提供依据。
作为冷冻电镜(cryo-EM)技术的开拓者,赛默飞世尔科技一直致力于该技术的研发和普及,在不断推出新产品的同时,还专门与客户合作开发了冷冻电镜免费在线学习工具 https://em-learning. com,为广大生命科学工作者及相关行业提供更完备更易用的解决方案。目前,赛默飞世尔科技冷 冻电镜产品家族包括:
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图3. 赛默飞世尔科技冷冻电镜产品家族图片
同样在结构分析方面,还可以利用Orbitrap 高分辨质谱解析具有挑战性的天然和生物治疗性蛋白的组装,如核糖体颗粒、基于蛋白质的 纳米颗粒,及分析病毒组装的异质性,区分加 载不同基因组或片段的病毒颗粒,为病毒性质 和质控提供重要信息,整体解决方案图4所示
非变性质谱(Native MS)即保证被分析病 毒或蛋白处于非变性状态,维持其原有的空间 构象,通过高分辨质谱获得完整病毒颗粒或蛋 白、蛋白复合物的分子量,用于研究病毒蛋白 组装、加载蛋白的化学计量学、病毒异质性和 病毒蛋白与宿主蛋白相互作用等领域可以通过 Orbitrap 高分辨质谱测定不同质量大小的蛋白及 核糖体、颗粒,并区分空壳和基因加载腺病毒 颗粒(Journal of the American Chemical Society, 2014, 136(20):7295-7299.), 如下图所示。
图5. 非变性质谱(Native MS)分析病毒颗粒蛋白复合物具体流程
氢氘交换质谱(HDX-MS)即将非变性的目标蛋白、蛋白复合物、病毒衣壳蛋白置于氘水中, 放置不同时间后取出进行猝灭,在完整蛋白或多肽水平进行质谱测定,通过观测氢氘交换速率的变 化来确定蛋白或病毒衣壳蛋白空间结构变化以及衣壳蛋白与宿主蛋白相互作用区域。
相比于经典的结构学研究技术,无需大量的样本及复杂的晶体制备,对样品要求较低,能够实 现从完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平上获得详细信息,使得最终的蛋白质高级结构的信 息更加全面和准确(Biophysical journal, 2017, 112(6): 1157-1165)。技术路线见下图。
图6. 研究病毒衣壳蛋白空间变化的HDX-MS 实验流程
通过结合免疫沉淀富集功能,结合 LC-MS 的多反应监测功能对病毒抗原的特征项肽段进行检测,从而能直接对患者血液样本中与疾病相关的抗原定量分析, 不但能快速检测出病毒,并且可以通过病毒体内检测浓度的变化对感染的患者进行监测,确定感染阶段以及评估病患对药物的反应,及时调整治疗方案。根据实际临床需求,可以通过进一步优化方案,同时对多个病毒抗原进行检测,例如针对 HIV/TB 合并感染的患者的联合检测方案。
图 7. Nanopin 结合 LC-MS 血液样本中检测与疾病相关的抗原实验流程
病毒个体微小,结构简单,由核酸和蛋白质组成,且只含一种核酸(DNA 或 RNA),必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物,离开宿主无法单独存活。因此研究病毒侵染细胞前后的蛋白质组变化研究,有利于发现病毒侵染轨迹和致病机制,从而寻求阻断方法。赛默飞高分辨质谱技术 Orbitrap,凭借其高灵敏度、高精度、高通量等特性在该领域表现出色,能有效应用于病毒侵染前后宿主细胞的蛋白质组变化。
基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行赛默飞世尔科技高分辨质谱分析(AP-Orbitrap)的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒 - 宿主多蛋白复合物,可识别间接和直接的蛋白质相互作用,提供相互作用事件的瞬时信息,或跟踪单个病毒基因产物的过表达,以深入了解单个蛋白质的功能;表达蛋白质组学技术(定量蛋白质组学和翻译后修饰组学)可以研究病毒蛋白的组成,宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化 (Viruses 2019, 11, 878; doi:10.3390/v11090878)。相关策略见图 8。
图 8. 利用蛋白质组学技术分析宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化
例如,寨卡病毒(ZIKV)是世界范围内的公共卫生问题,但是目前尚无许可的药物或疫苗。尽管越来越多的证据将 ZIKV 感染与婴儿的小头畸形和先天性眼病以及成人的 Guillain-Barré 综合征,不育和眼部异常相关联,但目前尚不清楚导致这些病理结果的潜在细胞途径。为了更好地了解病毒与宿主细胞蛋白之间的相互作用,利用 Orbitrap 质谱技术进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学(图 9),研究对象为神经细胞系 SK-N-BE2 和 NPC 细胞,表征细胞对病毒的反应,在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化,利用亲和蛋白组学方法鉴定 ZIKV 蛋白的细胞靶点。使用这种方法,找到了 386个与 Zikv 相互作用的蛋白质,导致宿主在神经发育受损,视网膜缺陷和不孕。在功能上,系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动,并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,还利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证 (Nature volume 561, pages253–257(2018)
图 9. 蛋白质组学研究 ZIKV 诱导后的宿主药物干预后的蛋白动态变化流程
目前的研究显示,新型冠状病毒进入细胞的路径与 SARS 冠状病毒一样,均是通过血管紧张素转化酶 2(ACE2)细胞受体入侵宿主。但入侵之后,作为从基因到蛋白作用下游的小分子,其发生的变化尚未可知。开展针对这些入侵后代谢物组和脂质组的研究,将为明确病毒 - 宿主相互作用,了解其相互作用的关系,从而加速开发新的更有针对性的治疗和检测手段,同时为疫苗的开发和效果预测提供帮助。
小分子代谢物对免疫细胞的增殖分化及其功能息息相关,同时不同年龄层,性别因素对疫苗接种效果有显著的差异。 2017 年发表在 Cell 杂志的一项研究,整合转录组学和代谢组学研究显示,代谢反应是人类对带状疱疹病毒疫苗的免疫反应有效性的基础。研究人员采用带状疱疹病毒疫苗接种在健康成人上的纵向研究,结果显示,接种疫苗后,嘌呤代谢,亚油酸代谢、蛋氨酸和半胱氨酸代谢、甘油磷脂代谢和糖磷脂代谢等于转录组学密切相关。通过构建 MMRN 网络,结合接种者年龄、性别和病毒载量相关的网络来预测有效性,揭示甾醇代谢整合了体液免疫与细胞免疫的联系,磷酸肌醇代谢提供了代谢表型,影响免疫结果。
图 10. 结合代谢组学组学和转录技术分析病毒疫苗免疫应答机制
通过此项研究,可以帮助研究人员对疫苗接种的免疫反应进行情境分析,确定影响疗效的相关因素,同时为免疫反应提供新的生物学见解,促进未来的生物标记物研究和疫苗开发。(Cell. 2017;169(5):862–877.e17.)
与此同时,探讨新型冠状病毒感染引起急性呼吸窘迫综合征的发病机制,筛选有助于诊断和治疗的生物标志物,也可为及时控制病情发展、减少重症疾病的发生提供理论依据。赛默飞在代谢组学研究中提供全流程方案,有利于生物标志物的寻找。埃博拉病毒是目前最致命的烈性传染病之一,死亡率高达 50% 以上。研究人员通过研究埃博拉病毒感染幸存者,致死患者死亡前样本,以及健康志愿者样本,整合代谢组学、脂质组学、蛋白组学和转录组学的多组学分析结果。结果筛选出 11 个 Biomarkers,能有效地区分病毒感染致死患者和幸存者样本。
通过此研究,可以帮助研究者探究不同患者对埃博拉病毒反应差异的机制,并寻找感染病毒死亡病例的生物标志物。(Cell Host & Microbe: Volume 22, Issue 6, 13 December 2017, P 817-829.e8)
图 11. 结合脂质组学等多组学技术寻找 Biomarker(左);赛默飞代谢脂质组学研究方案(右)
赛默飞荧光定量 PCR 仪助力 COVID-19 药物开发。在药物开发阶段,使用 qPCR 仪器可以检测使用药物是否会减少病毒量,从而判断药物作用;在临床试用上,也可以使用荧光定量PCR 仪监控病毒感染的动态变化。另外,赛默飞数字 PCR 仪无需对照样品和标准品即可精确定量检测病毒载量,帮助病情诊断辅助指导用药。衡量病毒载量对于判断药物作用、药效药理评估,以及诊断病程和预后状况都将起到巨大作用。
与此同时,我们也看到有新闻报道中医药在新冠肺炎的防治上显示出非常好的疗效,各省市均广泛结合中医药进行治疗。新冠肺炎诊疗方案第六版中列举了医学观察期、临床治疗期(初期至中、重证,恢复期)的中医治疗药方,体现了中医辨证论治原则。
赛默飞可提供完整的中药分析解决方案,涵盖了从药用植物天然产物分析到中药治疗控制,临床中药代谢组学分析等应用领域,确保中药质量,阐明作用机理,明确中医药临床价值。
图 12. 中药成分和中药代谢组学解决方案
采用 Q Exactive 高分辨质谱对附子黄芪配伍理论进行了分析。依据中医药性理论,黄芪具有补气升阳,固表止汗,利水消肿的作用;附子具有回阳救逆,温肾助阳,祛寒止痛作用。我们对附子单煎组、黄芪单煎组、附子黄芪合煎组、附子黄芪混合的化学成分进行系统考察,以期为黄芪附子药对的临床应用提供理论依据。
图 13. 附子黄芪合煎组在正负离子模式下的鉴定结果
利用 Compound Discoverer 软件,结合标准中药数据库及公开数据库模式对样品中的化合物进行鉴定,共鉴定 179 种可能的成分,主要为氨基酸、生物碱、黄芪皂苷、黄酮类。这些鉴定成分为黄芪对附子的解毒机理提供了物质基础。
图 14. 附子黄芪配伍理论统计学分析
现代药理研究表明,附子与黄芪配伍使用,LD50 值显著增大,表明黄芪对附子有显著的解毒作用。按照 p≤0.05, FC ≥2 为标准选择差异性代谢物,附子黄芪合煎组中可见乌头碱、新乌头碱等双酯型乌头碱含量降低。文献报道,双酯型乌头碱是附子中主要毒性成分,这与合煎组此类物质含量的降低相互验证,为黄芪附子药对的减毒机制和临床应用提供理论依据。最终药物离不开临床实验,此次抗疫活动中,瑞德西韦引起的大家的注意,这个药物能否起到作用还有待研究,尤其 是临床实验,必不可少。在临床试验中不可缺少的一环就是生物样品分析。通过受试者血浆,血清等生物样本的分析,提供药物在体内药代动力学信息,目前最主要的分析手段是通过液相 - 串联质谱联用技术。同时,因新冠患者的临床症状,不同的患病人群如孕妇、儿童等的治疗方案存在不同,液质联用技术可提供治疗药物监测数据,帮助医生调整用药方案和剂量。
这里,我们以艾滋病治疗药物监测实验为例,该研究通过对 14 种抗逆转录病毒药物和 2 种助推器药物在人血浆中的定量进行了验证。赛默飞三重四极杆质谱方法准确、特异性强、重复性好(J Pharm Biomed Anal. 2019;181:113057. doi:10.1016/j.jpba.2019.113057)。
临床上抗病毒治疗方案中,药物联用是重要的治疗手段之一,因此一个方法中包含多化合物检测是必要的。 Transcend TLX1 联合 TSQ Altis 提供的快速样本制备,所有化合物的快速检测,对生物样本分析的时效性提供非常重要的技术支撑,非常适合于临床药代动力学和治疗药物监测研究。
图 15. 16 种分析物的化学结构(上)和对应的叠加离子流图(下)
世界卫生组织总干事谭德塞不止一次高度 评价中国此次抗击疫情的努力,其中很重要的 原因之一就是中国以前所未有的速度分离出病 毒,进行基因测序并立即同世卫组织分享。病 毒毒株的分离,是对病毒开展系列研究的重要前提。
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核心优势
在电子显微镜下,新型冠状病毒的外膜上有明显的棒状粒子突起,呈球形或椭圆形,使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠,因此获名“冠状病毒”。
2020年2月15日,美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan教授团队和美国国立卫生研究院NIH联合在预印版网站bioRxiv上发表了首篇使用冷冻电镜解析新冠病毒S蛋白的研究文章。Jason Mclellan团队通过冷冻电镜Cryo-EM技术,解析了新冠病毒S蛋白三聚体的3.5Å的近原子分辨率结构,从生物物理及结构生物学的角度加深了我们对新冠病毒的认知。
奥斯汀分校的研究团队展示了新冠病毒的S 蛋白结构。然 而,ACE2 到底在细胞膜上是以什么状态存在?新冠病毒对比 SARS 病毒与ACE2 结合有何异同?获取ACE2 的全长蛋白及 其与S 蛋白的复合物结构,将有助于解答上述疑问。 2020 年 2 月19 日,西湖大学周强实验室利用冷冻电镜技术首次成功 解析此次新冠病毒的受体——ACE2 的全长结构。
图2. ACE2-B0AT1 复合物和之前解析复合物(SARS-CoV 的S 蛋白与ACE2 的PD 结 构域的复合物)的比较,两种复合物通过PD 结构域锚定在一起。(引用来源:https:// mp.weixin.qq.com/s/WoYgx3wejD9f9mSVj9q7KQ)
冷冻电镜工作流程:首先通过快速冲入式冷冻,在载网上形成一层薄的无定形冰,这个过程可 以将病毒蛋白或者受感染的细胞保存于接近天然状态的结构,然后在冷冻电镜上采集数据,最后通 过三维重构获得病毒近原子级分辨率的结构,甚至可以看到病毒和宿主细胞结合的过程,以了解其侵入机制,实现从结构到功能的飞跃,从而为未来抗病毒药物的开发提供依据。
作为冷冻电镜(cryo-EM)技术的开拓者,赛默飞世尔科技一直致力于该技术的研发和普及,在不断推出新产品的同时,还专门与客户合作开发了冷冻电镜免费在线学习工具 https://em-learning. com,为广大生命科学工作者及相关行业提供更完备更易用的解决方案。目前,赛默飞世尔科技冷 冻电镜产品家族包括:
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图3. 赛默飞世尔科技冷冻电镜产品家族图片
同样在结构分析方面,还可以利用Orbitrap 高分辨质谱解析具有挑战性的天然和生物治疗性蛋白的组装,如核糖体颗粒、基于蛋白质的 纳米颗粒,及分析病毒组装的异质性,区分加 载不同基因组或片段的病毒颗粒,为病毒性质 和质控提供重要信息,整体解决方案图4所示
图4. 病毒蛋白复合物结构分析流程完整研究策略
非变性质谱(Native MS)即保证被分析病 毒或蛋白处于非变性状态,维持其原有的空间 构象,通过高分辨质谱获得完整病毒颗粒或蛋 白、蛋白复合物的分子量,用于研究病毒蛋白 组装、加载蛋白的化学计量学、病毒异质性和 病毒蛋白与宿主蛋白相互作用等领域可以通过 Orbitrap 高分辨质谱测定不同质量大小的蛋白及 核糖体、颗粒,并区分空壳和基因加载腺病毒 颗粒(Journal of the American Chemical Society, 2014, 136(20):7295-7299.), 如下图所示。
图5. 非变性质谱(Native MS)分析病毒颗粒蛋白复合物具体流程
氢氘交换质谱(HDX-MS)即将非变性的目标蛋白、蛋白复合物、病毒衣壳蛋白置于氘水中, 放置不同时间后取出进行猝灭,在完整蛋白或多肽水平进行质谱测定,通过观测氢氘交换速率的变 化来确定蛋白或病毒衣壳蛋白空间结构变化以及衣壳蛋白与宿主蛋白相互作用区域。
相比于经典的结构学研究技术,无需大量的样本及复杂的晶体制备,对样品要求较低,能够实 现从完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平上获得详细信息,使得最终的蛋白质高级结构的信 息更加全面和准确(Biophysical journal, 2017, 112(6): 1157-1165)。技术路线见下图。
图6. 研究病毒衣壳蛋白空间变化的HDX-MS 实验流程
通过结合免疫沉淀富集功能,结合 LC-MS 的多反应监测功能对病毒抗原的特征项肽段进行检测,从而能直接对患者血液样本中与疾病相关的抗原定量分析, 不但能快速检测出病毒,并且可以通过病毒体内检测浓度的变化对感染的患者进行监测,确定感染阶段以及评估病患对药物的反应,及时调整治疗方案。根据实际临床需求,可以通过进一步优化方案,同时对多个病毒抗原进行检测,例如针对 HIV/TB 合并感染的患者的联合检测方案。
图 7. Nanopin 结合 LC-MS 血液样本中检测与疾病相关的抗原实验流程
病毒个体微小,结构简单,由核酸和蛋白质组成,且只含一种核酸(DNA 或 RNA),必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物,离开宿主无法单独存活。因此研究病毒侵染细胞前后的蛋白质组变化研究,有利于发现病毒侵染轨迹和致病机制,从而寻求阻断方法。赛默飞高分辨质谱技术 Orbitrap,凭借其高灵敏度、高精度、高通量等特性在该领域表现出色,能有效应用于病毒侵染前后宿主细胞的蛋白质组变化。
基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行赛默飞世尔科技高分辨质谱分析(AP-Orbitrap)的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒 - 宿主多蛋白复合物,可识别间接和直接的蛋白质相互作用,提供相互作用事件的瞬时信息,或跟踪单个病毒基因产物的过表达,以深入了解单个蛋白质的功能;表达蛋白质组学技术(定量蛋白质组学和翻译后修饰组学)可以研究病毒蛋白的组成,宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化 (Viruses 2019, 11, 878; doi:10.3390/v11090878)。相关策略见图 8。
图 8. 利用蛋白质组学技术分析宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化
例如,寨卡病毒(ZIKV)是世界范围内的公共卫生问题,但是目前尚无许可的药物或疫苗。尽管越来越多的证据将 ZIKV 感染与婴儿的小头畸形和先天性眼病以及成人的 Guillain-Barré 综合征,不育和眼部异常相关联,但目前尚不清楚导致这些病理结果的潜在细胞途径。为了更好地了解病毒与宿主细胞蛋白之间的相互作用,利用 Orbitrap 质谱技术进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学(图 9),研究对象为神经细胞系 SK-N-BE2 和 NPC 细胞,表征细胞对病毒的反应,在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化,利用亲和蛋白组学方法鉴定 ZIKV 蛋白的细胞靶点。使用这种方法,找到了 386个与 Zikv 相互作用的蛋白质,导致宿主在神经发育受损,视网膜缺陷和不孕。在功能上,系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动,并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,还利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证 (Nature volume 561, pages253–257(2018)
图 9. 蛋白质组学研究 ZIKV 诱导后的宿主药物干预后的蛋白动态变化流程
目前的研究显示,新型冠状病毒进入细胞的路径与 SARS 冠状病毒一样,均是通过血管紧张素转化酶 2(ACE2)细胞受体入侵宿主。但入侵之后,作为从基因到蛋白作用下游的小分子,其发生的变化尚未可知。开展针对这些入侵后代谢物组和脂质组的研究,将为明确病毒 - 宿主相互作用,了解其相互作用的关系,从而加速开发新的更有针对性的治疗和检测手段,同时为疫苗的开发和效果预测提供帮助。
小分子代谢物对免疫细胞的增殖分化及其功能息息相关,同时不同年龄层,性别因素对疫苗接种效果有显著的差异。 2017 年发表在 Cell 杂志的一项研究,整合转录组学和代谢组学研究显示,代谢反应是人类对带状疱疹病毒疫苗的免疫反应有效性的基础。研究人员采用带状疱疹病毒疫苗接种在健康成人上的纵向研究,结果显示,接种疫苗后,嘌呤代谢,亚油酸代谢、蛋氨酸和半胱氨酸代谢、甘油磷脂代谢和糖磷脂代谢等于转录组学密切相关。通过构建 MMRN 网络,结合接种者年龄、性别和病毒载量相关的网络来预测有效性,揭示甾醇代谢整合了体液免疫与细胞免疫的联系,磷酸肌醇代谢提供了代谢表型,影响免疫结果。
图 10. 结合代谢组学组学和转录技术分析病毒疫苗免疫应答机制
通过此项研究,可以帮助研究人员对疫苗接种的免疫反应进行情境分析,确定影响疗效的相关因素,同时为免疫反应提供新的生物学见解,促进未来的生物标记物研究和疫苗开发。(Cell. 2017;169(5):862–877.e17.)
与此同时,探讨新型冠状病毒感染引起急性呼吸窘迫综合征的发病机制,筛选有助于诊断和治疗的生物标志物,也可为及时控制病情发展、减少重症疾病的发生提供理论依据。赛默飞在代谢组学研究中提供全流程方案,有利于生物标志物的寻找。埃博拉病毒是目前最致命的烈性传染病之一,死亡率高达 50% 以上。研究人员通过研究埃博拉病毒感染幸存者,致死患者死亡前样本,以及健康志愿者样本,整合代谢组学、脂质组学、蛋白组学和转录组学的多组学分析结果。结果筛选出 11 个 Biomarkers,能有效地区分病毒感染致死患者和幸存者样本。
通过此研究,可以帮助研究者探究不同患者对埃博拉病毒反应差异的机制,并寻找感染病毒死亡病例的生物标志物。(Cell Host & Microbe: Volume 22, Issue 6, 13 December 2017, P 817-829.e8)
图 11. 结合脂质组学等多组学技术寻找 Biomarker(左);赛默飞代谢脂质组学研究方案(右)
赛默飞荧光定量 PCR 仪助力 COVID-19 药物开发。在药物开发阶段,使用 qPCR 仪器可以检测使用药物是否会减少病毒量,从而判断药物作用;在临床试用上,也可以使用荧光定量PCR 仪监控病毒感染的动态变化。另外,赛默飞数字 PCR 仪无需对照样品和标准品即可精确定量检测病毒载量,帮助病情诊断辅助指导用药。衡量病毒载量对于判断药物作用、药效药理评估,以及诊断病程和预后状况都将起到巨大作用。
与此同时,我们也看到有新闻报道中医药在新冠肺炎的防治上显示出非常好的疗效,各省市均广泛结合中医药进行治疗。新冠肺炎诊疗方案第六版中列举了医学观察期、临床治疗期(初期至中、重证,恢复期)的中医治疗药方,体现了中医辨证论治原则。
赛默飞可提供完整的中药分析解决方案,涵盖了从药用植物天然产物分析到中药治疗控制,临床中药代谢组学分析等应用领域,确保中药质量,阐明作用机理,明确中医药临床价值。
图 12. 中药成分和中药代谢组学解决方案
采用 Q Exactive 高分辨质谱对附子黄芪配伍理论进行了分析。依据中医药性理论,黄芪具有补气升阳,固表止汗,利水消肿的作用;附子具有回阳救逆,温肾助阳,祛寒止痛作用。我们对附子单煎组、黄芪单煎组、附子黄芪合煎组、附子黄芪混合的化学成分进行系统考察,以期为黄芪附子药对的临床应用提供理论依据。
图 13. 附子黄芪合煎组在正负离子模式下的鉴定结果
利用 Compound Discoverer 软件,结合标准中药数据库及公开数据库模式对样品中的化合物进行鉴定,共鉴定 179 种可能的成分,主要为氨基酸、生物碱、黄芪皂苷、黄酮类。这些鉴定成分为黄芪对附子的解毒机理提供了物质基础。
图 14. 附子黄芪配伍理论统计学分析
现代药理研究表明,附子与黄芪配伍使用,LD50 值显著增大,表明黄芪对附子有显著的解毒作用。按照 p≤0.05, FC ≥2 为标准选择差异性代谢物,附子黄芪合煎组中可见乌头碱、新乌头碱等双酯型乌头碱含量降低。文献报道,双酯型乌头碱是附子中主要毒性成分,这与合煎组此类物质含量的降低相互验证,为黄芪附子药对的减毒机制和临床应用提供理论依据。最终药物离不开临床实验,此次抗疫活动中,瑞德西韦引起的大家的注意,这个药物能否起到作用还有待研究,尤其 是临床实验,必不可少。在临床试验中不可缺少的一环就是生物样品分析。通过受试者血浆,血清等生物样本的分析,提供药物在体内药代动力学信息,目前最主要的分析手段是通过液相 - 串联质谱联用技术。同时,因新冠患者的临床症状,不同的患病人群如孕妇、儿童等的治疗方案存在不同,液质联用技术可提供治疗药物监测数据,帮助医生调整用药方案和剂量。
这里,我们以艾滋病治疗药物监测实验为例,该研究通过对 14 种抗逆转录病毒药物和 2 种助推器药物在人血浆中的定量进行了验证。赛默飞三重四极杆质谱方法准确、特异性强、重复性好(J Pharm Biomed Anal. 2019;181:113057. doi:10.1016/j.jpba.2019.113057)。
临床上抗病毒治疗方案中,药物联用是重要的治疗手段之一,因此一个方法中包含多化合物检测是必要的。 Transcend TLX1 联合 TSQ Altis 提供的快速样本制备,所有化合物的快速检测,对生物样本分析的时效性提供非常重要的技术支撑,非常适合于临床药代动力学和治疗药物监测研究。
图 15. 16 种分析物的化学结构(上)和对应的叠加离子流图(下)
世界卫生组织总干事谭德塞不止一次高度 评价中国此次抗击疫情的努力,其中很重要的 原因之一就是中国以前所未有的速度分离出病 毒,进行基因测序并立即同世卫组织分享。病 毒毒株的分离,是对病毒开展系列研究的重要前提。
有了毒株,才能促进快速检测试剂盒的开发,才能开展一系列实验去探寻病毒基因组复 制、基因表达及其调控机制,提示病毒感染、 致病的分子本质,为病毒基因工程疫苗和抗病 毒药物的研制以及病毒病的诊断,预防和治疗 提供理论基础和依据。
可以看到,针对病毒分子机制的研究涉及到分子生物学,细胞生物学,蛋白生物学等各个学科 的研究领域,且相互交叉。赛默飞针对病毒鉴定、病毒与细胞之间的免疫反应检测、细胞凋亡检测 和细胞信号传导部分都有相关的解决方案供选择。
Thermo Scientific™ KingFisher Flex 是一款高通量自动化核酸提取仪器(具备NMPA,一类备案),适用于各类样本的核酸提取,能够提供更高效样品制备、更稳定的样品结果、更简单的样品分析。上市10年以来,从H1N1、SARS到H7N9、猪瘟,KingFisher始终坚守在重大疫情检测一线。
病微生物分子检测技术中最成熟、应用最为广泛的就是定量 PCR (RT-PCR) 技术,利用荧光标记的分子探针检测特定病原物的特征性序列位点,可以快速准确地实现感染样本筛查和病原物鉴定,操作简单,检测速度快,准确度高,成本低, 可以实现大量样本的快速准确筛查。
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十五年临床分子诊断全行业产品金标准,5色通道荧光检测, 新型光路设计,性能强大,结果稳定,模块化软件交互界面友好,反应设置快捷方便。临床绝大多数qPCR 检测试剂盒适配机型。
Applied Biosystem 7500 该款机型在临床市场上得到了高度的认可,而且该机型适配市场上绝大多数qPCR的IVD试剂盒。针对此次新冠状病毒的大多数试剂盒及目前所有获批的qPCR新冠状病毒检测试剂盒都可以在此款平台上面检测使用。
ViewRNA Assay
Ion S5 高通量测序平台
荧光 PCR 检测平台
viewRNA 技术
ELISA
ProcartaPlex
流式检测仪
流式检测抗体试剂
细胞凋亡
自噬
细胞毒性活力代谢
蛋白制备 & 纯化
Western Blot
基于LC3B和p62特异性追踪自噬过程:
我们提供各种试剂盒、试剂和实验用小装置,您可以轻松提取、纯化、除杂(脱盐、透析)并浓缩靶标蛋白质。 这些产品经过优化适用于多种组织和细胞类型,针对不同“个性”的靶标蛋白,提供了更多的选择以确保更好的蛋白回收率和蛋白活性。
赛默飞 iWestern 流程旨在提升实验效率、提高数据重现性和结果可靠性,致力于以最少的手动操作时间实现卓越的免疫印迹结果。
借助我们的iWestern 工作流程,实验室中的生活将会变得更轻松、更省时,可以腾出时间专注于最重要的事情–数据分析,并对研究进行深入思考。
病毒主要由核酸和蛋白质组成,结构相对简单,然后要对病毒结构做综合研究,需要配合生物化学和分子生物学方法研究蛋白结构与功能,各个层次的生命活动,都需要在分子水平上进行物质结构和功能的研究才能最终阐明其本质。赛默飞利用其全球化资源优势,为病毒结构研究添砖加瓦。
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Orbitrap 高分辨质谱
冷冻透射电镜
我们提供多种形式的蛋白质纯化和抗体纯化树脂,您可从中选出适合蛋白纯化实验流程的最佳方案。或者通过将特定配体共价交联到我们提供的活性介质上,获得您的定制化纯化树脂。
我们提供预先活化的磁珠、磁性琼脂糖微珠、标准品及Superflow琼脂糖树脂、POROS™ 树脂,以及其它色谱填料,可以进行几乎任何规模的蛋白质纯化:检测、筛选、小试、中试,以及工艺建立。
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作为革命性全新一代组合型超高分辨质谱系统,Orbitrap Exploris™ 480质谱仪占用的空间更小,同时保持了高分辨率、高质量精度和图谱质量。新仪器具有很多新特性,可以延长正常运行时间,并在高通量分析试验中提高超强稳定性 。其结合成熟的技术,先进的功能和智能驱动分析框架为研究科学家更广泛应用质谱进行高通量的蛋白质鉴定、定量和结构表征。全新的SureQuant及BoxCar方法包为超敏感目标蛋白定量提供强大助力。其新增主要性能如下:
新一代Thermo Scientific Krios G4冷冻透射电镜(Cryo-TEM)使您能够在分子水平上更容易、更快、更可靠地揭示生命。最紧凑设计的Krios G4配备了高度稳定的300 kV TEM平台和行业领先的Autoloader设备,适应于冷冻电镜单颗粒分析(SPA)、冷冻电子断层扫描(cryo-tomography)和微电子衍射(MicroED),让每位用户包括新用户都能很容易得到最佳的实验结果。通过对机械底座框架和设备外壳的全新设计,该款设备净身高缩短至 3 m 以内,适用于任何天花板高度在 3.04 m(10 ft)以上的实验室,由此可省去昂贵的实验室改造费用。
核心优势
在电子显微镜下,新型冠状病毒的外膜上有明显的棒状粒子突起,呈球形或椭圆形,使其形态看上去像中世纪欧洲帝王的皇冠,因此获名“冠状病毒”。
2020年2月15日,美国得克萨斯大学奥斯汀分校Jason S. McLellan教授团队和美国国立卫生研究院NIH联合在预印版网站bioRxiv上发表了首篇使用冷冻电镜解析新冠病毒S蛋白的研究文章。Jason Mclellan团队通过冷冻电镜Cryo-EM技术,解析了新冠病毒S蛋白三聚体的3.5Å的近原子分辨率结构,从生物物理及结构生物学的角度加深了我们对新冠病毒的认知。
奥斯汀分校的研究团队展示了新冠病毒的S 蛋白结构。然 而,ACE2 到底在细胞膜上是以什么状态存在?新冠病毒对比 SARS 病毒与ACE2 结合有何异同?获取ACE2 的全长蛋白及 其与S 蛋白的复合物结构,将有助于解答上述疑问。 2020 年 2 月19 日,西湖大学周强实验室利用冷冻电镜技术首次成功 解析此次新冠病毒的受体——ACE2 的全长结构。
图2. ACE2-B0AT1 复合物和之前解析复合物(SARS-CoV 的S 蛋白与ACE2 的PD 结 构域的复合物)的比较,两种复合物通过PD 结构域锚定在一起。(引用来源:https:// mp.weixin.qq.com/s/WoYgx3wejD9f9mSVj9q7KQ)
冷冻电镜工作流程:首先通过快速冲入式冷冻,在载网上形成一层薄的无定形冰,这个过程可 以将病毒蛋白或者受感染的细胞保存于接近天然状态的结构,然后在冷冻电镜上采集数据,最后通 过三维重构获得病毒近原子级分辨率的结构,甚至可以看到病毒和宿主细胞结合的过程,以了解其侵入机制,实现从结构到功能的飞跃,从而为未来抗病毒药物的开发提供依据。
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图3. 赛默飞世尔科技冷冻电镜产品家族图片
同样在结构分析方面,还可以利用Orbitrap 高分辨质谱解析具有挑战性的天然和生物治疗性蛋白的组装,如核糖体颗粒、基于蛋白质的 纳米颗粒,及分析病毒组装的异质性,区分加 载不同基因组或片段的病毒颗粒,为病毒性质 和质控提供重要信息,整体解决方案图4所示
图4. 病毒蛋白复合物结构分析流程完整研究策略
非变性质谱(Native MS)即保证被分析病 毒或蛋白处于非变性状态,维持其原有的空间 构象,通过高分辨质谱获得完整病毒颗粒或蛋 白、蛋白复合物的分子量,用于研究病毒蛋白 组装、加载蛋白的化学计量学、病毒异质性和 病毒蛋白与宿主蛋白相互作用等领域可以通过 Orbitrap 高分辨质谱测定不同质量大小的蛋白及 核糖体、颗粒,并区分空壳和基因加载腺病毒 颗粒(Journal of the American Chemical Society, 2014, 136(20):7295-7299.), 如下图所示。
图5. 非变性质谱(Native MS)分析病毒颗粒蛋白复合物具体流程
氢氘交换质谱(HDX-MS)即将非变性的目标蛋白、蛋白复合物、病毒衣壳蛋白置于氘水中, 放置不同时间后取出进行猝灭,在完整蛋白或多肽水平进行质谱测定,通过观测氢氘交换速率的变 化来确定蛋白或病毒衣壳蛋白空间结构变化以及衣壳蛋白与宿主蛋白相互作用区域。
相比于经典的结构学研究技术,无需大量的样本及复杂的晶体制备,对样品要求较低,能够实 现从完整水平、局部水平以及单个氨基酸的水平上获得详细信息,使得最终的蛋白质高级结构的信 息更加全面和准确(Biophysical journal, 2017, 112(6): 1157-1165)。技术路线见下图。
图6. 研究病毒衣壳蛋白空间变化的HDX-MS 实验流程
通过结合免疫沉淀富集功能,结合 LC-MS 的多反应监测功能对病毒抗原的特征项肽段进行检测,从而能直接对患者血液样本中与疾病相关的抗原定量分析, 不但能快速检测出病毒,并且可以通过病毒体内检测浓度的变化对感染的患者进行监测,确定感染阶段以及评估病患对药物的反应,及时调整治疗方案。根据实际临床需求,可以通过进一步优化方案,同时对多个病毒抗原进行检测,例如针对 HIV/TB 合并感染的患者的联合检测方案。
图 7. Nanopin 结合 LC-MS 血液样本中检测与疾病相关的抗原实验流程
病毒个体微小,结构简单,由核酸和蛋白质组成,且只含一种核酸(DNA 或 RNA),必须在活细胞内寄生并以复制方式增殖的非细胞型生物,离开宿主无法单独存活。因此研究病毒侵染细胞前后的蛋白质组变化研究,有利于发现病毒侵染轨迹和致病机制,从而寻求阻断方法。赛默飞高分辨质谱技术 Orbitrap,凭借其高灵敏度、高精度、高通量等特性在该领域表现出色,能有效应用于病毒侵染前后宿主细胞的蛋白质组变化。
基于亲和纯化分离蛋白质复合物随后进行赛默飞世尔科技高分辨质谱分析(AP-Orbitrap)的方法可以用于分离病毒-病毒和病毒 - 宿主多蛋白复合物,可识别间接和直接的蛋白质相互作用,提供相互作用事件的瞬时信息,或跟踪单个病毒基因产物的过表达,以深入了解单个蛋白质的功能;表达蛋白质组学技术(定量蛋白质组学和翻译后修饰组学)可以研究病毒蛋白的组成,宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化 (Viruses 2019, 11, 878; doi:10.3390/v11090878)。相关策略见图 8。
图 8. 利用蛋白质组学技术分析宿主在病毒入侵过程中蛋白质和翻译后修饰的动态变化
例如,寨卡病毒(ZIKV)是世界范围内的公共卫生问题,但是目前尚无许可的药物或疫苗。尽管越来越多的证据将 ZIKV 感染与婴儿的小头畸形和先天性眼病以及成人的 Guillain-Barré 综合征,不育和眼部异常相关联,但目前尚不清楚导致这些病理结果的潜在细胞途径。为了更好地了解病毒与宿主细胞蛋白之间的相互作用,利用 Orbitrap 质谱技术进行全蛋白质组学和修饰蛋白质组学(图 9),研究对象为神经细胞系 SK-N-BE2 和 NPC 细胞,表征细胞对病毒的反应,在蛋白质组和磷酸化蛋白质组水平上的变化,利用亲和蛋白组学方法鉴定 ZIKV 蛋白的细胞靶点。使用这种方法,找到了 386个与 Zikv 相互作用的蛋白质,导致宿主在神经发育受损,视网膜缺陷和不孕。在功能上,系统地理解了ZIKV诱导后的宿主的蛋白质和细胞通路水平的扰动,并对感染后细胞施加Rock抑制剂药物干预,还利用非标定量蛋白质组学方法分析差异蛋白进行验证 (Nature volume 561, pages253–257(2018)
图 9. 蛋白质组学研究 ZIKV 诱导后的宿主药物干预后的蛋白动态变化流程
目前的研究显示,新型冠状病毒进入细胞的路径与 SARS 冠状病毒一样,均是通过血管紧张素转化酶 2(ACE2)细胞受体入侵宿主。但入侵之后,作为从基因到蛋白作用下游的小分子,其发生的变化尚未可知。开展针对这些入侵后代谢物组和脂质组的研究,将为明确病毒 - 宿主相互作用,了解其相互作用的关系,从而加速开发新的更有针对性的治疗和检测手段,同时为疫苗的开发和效果预测提供帮助。
小分子代谢物对免疫细胞的增殖分化及其功能息息相关,同时不同年龄层,性别因素对疫苗接种效果有显著的差异。 2017 年发表在 Cell 杂志的一项研究,整合转录组学和代谢组学研究显示,代谢反应是人类对带状疱疹病毒疫苗的免疫反应有效性的基础。研究人员采用带状疱疹病毒疫苗接种在健康成人上的纵向研究,结果显示,接种疫苗后,嘌呤代谢,亚油酸代谢、蛋氨酸和半胱氨酸代谢、甘油磷脂代谢和糖磷脂代谢等于转录组学密切相关。通过构建 MMRN 网络,结合接种者年龄、性别和病毒载量相关的网络来预测有效性,揭示甾醇代谢整合了体液免疫与细胞免疫的联系,磷酸肌醇代谢提供了代谢表型,影响免疫结果。
图 10. 结合代谢组学组学和转录技术分析病毒疫苗免疫应答机制
通过此项研究,可以帮助研究人员对疫苗接种的免疫反应进行情境分析,确定影响疗效的相关因素,同时为免疫反应提供新的生物学见解,促进未来的生物标记物研究和疫苗开发。(Cell. 2017;169(5):862–877.e17.)
与此同时,探讨新型冠状病毒感染引起急性呼吸窘迫综合征的发病机制,筛选有助于诊断和治疗的生物标志物,也可为及时控制病情发展、减少重症疾病的发生提供理论依据。赛默飞在代谢组学研究中提供全流程方案,有利于生物标志物的寻找。埃博拉病毒是目前最致命的烈性传染病之一,死亡率高达 50% 以上。研究人员通过研究埃博拉病毒感染幸存者,致死患者死亡前样本,以及健康志愿者样本,整合代谢组学、脂质组学、蛋白组学和转录组学的多组学分析结果。结果筛选出 11 个 Biomarkers,能有效地区分病毒感染致死患者和幸存者样本。
通过此研究,可以帮助研究者探究不同患者对埃博拉病毒反应差异的机制,并寻找感染病毒死亡病例的生物标志物。(Cell Host & Microbe: Volume 22, Issue 6, 13 December 2017, P 817-829.e8)
图 11. 结合脂质组学等多组学技术寻找 Biomarker(左);赛默飞代谢脂质组学研究方案(右)
赛默飞荧光定量 PCR 仪助力 COVID-19 药物开发。在药物开发阶段,使用 qPCR 仪器可以检测使用药物是否会减少病毒量,从而判断药物作用;在临床试用上,也可以使用荧光定量PCR 仪监控病毒感染的动态变化。另外,赛默飞数字 PCR 仪无需对照样品和标准品即可精确定量检测病毒载量,帮助病情诊断辅助指导用药。衡量病毒载量对于判断药物作用、药效药理评估,以及诊断病程和预后状况都将起到巨大作用。
与此同时,我们也看到有新闻报道中医药在新冠肺炎的防治上显示出非常好的疗效,各省市均广泛结合中医药进行治疗。新冠肺炎诊疗方案第六版中列举了医学观察期、临床治疗期(初期至中、重证,恢复期)的中医治疗药方,体现了中医辨证论治原则。
赛默飞可提供完整的中药分析解决方案,涵盖了从药用植物天然产物分析到中药治疗控制,临床中药代谢组学分析等应用领域,确保中药质量,阐明作用机理,明确中医药临床价值。
图 12. 中药成分和中药代谢组学解决方案
采用 Q Exactive 高分辨质谱对附子黄芪配伍理论进行了分析。依据中医药性理论,黄芪具有补气升阳,固表止汗,利水消肿的作用;附子具有回阳救逆,温肾助阳,祛寒止痛作用。我们对附子单煎组、黄芪单煎组、附子黄芪合煎组、附子黄芪混合的化学成分进行系统考察,以期为黄芪附子药对的临床应用提供理论依据。
图 13. 附子黄芪合煎组在正负离子模式下的鉴定结果
利用 Compound Discoverer 软件,结合标准中药数据库及公开数据库模式对样品中的化合物进行鉴定,共鉴定 179 种可能的成分,主要为氨基酸、生物碱、黄芪皂苷、黄酮类。这些鉴定成分为黄芪对附子的解毒机理提供了物质基础。
图 14. 附子黄芪配伍理论统计学分析
现代药理研究表明,附子与黄芪配伍使用,LD50 值显著增大,表明黄芪对附子有显著的解毒作用。按照 p≤0.05, FC ≥2 为标准选择差异性代谢物,附子黄芪合煎组中可见乌头碱、新乌头碱等双酯型乌头碱含量降低。文献报道,双酯型乌头碱是附子中主要毒性成分,这与合煎组此类物质含量的降低相互验证,为黄芪附子药对的减毒机制和临床应用提供理论依据。最终药物离不开临床实验,此次抗疫活动中,瑞德西韦引起的大家的注意,这个药物能否起到作用还有待研究,尤其 是临床实验,必不可少。在临床试验中不可缺少的一环就是生物样品分析。通过受试者血浆,血清等生物样本的分析,提供药物在体内药代动力学信息,目前最主要的分析手段是通过液相 - 串联质谱联用技术。同时,因新冠患者的临床症状,不同的患病人群如孕妇、儿童等的治疗方案存在不同,液质联用技术可提供治疗药物监测数据,帮助医生调整用药方案和剂量。
这里,我们以艾滋病治疗药物监测实验为例,该研究通过对 14 种抗逆转录病毒药物和 2 种助推器药物在人血浆中的定量进行了验证。赛默飞三重四极杆质谱方法准确、特异性强、重复性好(J Pharm Biomed Anal. 2019;181:113057. doi:10.1016/j.jpba.2019.113057)。
临床上抗病毒治疗方案中,药物联用是重要的治疗手段之一,因此一个方法中包含多化合物检测是必要的。 Transcend TLX1 联合 TSQ Altis 提供的快速样本制备,所有化合物的快速检测,对生物样本分析的时效性提供非常重要的技术支撑,非常适合于临床药代动力学和治疗药物监测研究。
图 15. 16 种分析物的化学结构(上)和对应的叠加离子流图(下)