Champion™ pET100 定向 TOPO™ 表达试剂盒，含 BL21 Star™ (DE3) One Shot™ 化学感受态大肠杆菌

有多种措施可防止由毒性基因本底水平表达带来的问题。这些方法均基于T7或Champion表达质粒的设计和构建是正确的：

•在不含T7 RNA聚合酶（即，DH5α）的菌株中繁殖和维持表达质粒。
•如果使用BL21 (DE3)菌株，应在室温而非37°C下生长24-48小时。
•新鲜转化严格调控的大肠杆菌菌株，如BL21-AI菌株。
•转化实验后，将转化反应接种在含100 μg/mL氨苄青霉素和0.1%葡萄糖的LB板上。葡萄糖可抑制T7 RNA聚合酶的本底表达。
•完成BL21-AI菌株的转化后，挑选3或4个转化株直接接种到新制备的含100 μg/mL 氨苄青霉素或50 μg/mL 羧苄青霉素（以及0.1%葡萄糖，如果需要的话）的LB培养基中。当培养物的OD600值达到0.4时，可加入终浓度为0.2%的L-阿拉伯糖来诱导重组蛋白的表达。
•在表达实验中，在生长培养基中补充0.1%葡萄糖和0.2%阿拉伯糖。
•尝试使用调控型细菌表达系统，如我们的pBAD系统。

通常，如果您看见1-2条主带，则表示密码子使用偏好导致了翻译过早终止。发生降解时，通常可看到梯度条带。发生降解时，可尝试在裂解缓冲液中加入蛋白酶抑制剂有助于防止降解。如果是这种情况，可通过时间点实验来确定收细胞的最佳时间。

如果存在溶解性问题，可尝试在诱导时降低温度或减少IPTG用量。也可尝试使用不同的、更严格的菌株进行表达。此外，在表达期间，也可将细菌培养基的葡萄糖含量增加至1%。

使用新鲜的细菌培养物进行接种，因为新鲜的细菌菌落通常可得到较高的蛋白得率。

检查重组蛋白序列中的不常用密码子。利用常用密码子代替稀有密码子，可显著提高表达水平。例如，精氨酸密码子AGG和AGA是大肠杆菌的不常用的密码子，所以这些密码子的tRNA水平低。

进行蛋白纯化时，在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂，如PMSF。使用新鲜配制的PMSF，因为PMSF被稀释到水溶液中后30分钟内会失效。

如果您在表达实验中使用氨苄青霉素进行筛选，则可能会因为筛选条件缺失而出现质粒不稳定。这是因为氨苄青霉素被β-内酰胺酶破坏，或者在由细菌代谢物造成的酸性培养基条件下发生水解。在转化和表达实验中，可使用羧苄青霉素替代氨苄青霉素。

重组蛋白可能对细菌细胞具有毒性作用。应选择更严格调控的系统用于表达，如BL21-AI。也可考虑尝试使用不同的表达系统，如pBAD系统。

当您的目的基因具有毒性时这种情况很常见。尝试使用更严格调控的系统，如BL21 (DE3) (pLysS)或BL21 (DE3) (pLysE)或BL21(AI)。