pHrodo标记试剂探索细胞吞噬的奥秘

上一期的推文中，我们介绍了脂代谢研究过程中，低密度脂蛋白（LDL）的类型与各类荧光标记LDL。其中我们提到了一类特殊的荧光基团pHrodo™，那么pHrodo™标记的LDL有什么特别应用呢？什么是pHrodo™呢？除了标记LDL以外，pHrodo™是否还可以用在其他地方呢？跟随Dr.赛，让我们一探究竟。

pHrodo™标记的LDL在脂代谢研究应用

细胞内的胆固醇稳态涉及胆固醇的代谢消耗与转运合成。其中，胆固醇在机体内的转运依赖脂蛋白，因此，通过追踪荧光标记的脂蛋白的摄取可以评估胆固醇在机体内的摄取转运能力。研究人员为了研究Zeb1蛋白在细胞内胆固醇转运中的潜在作用，将Zeb1^WT和Zeb1^ΔM的巨噬细胞分别与pHrodo™ Green偶联的LDL（pHrodo™ Green-LDL）共培养，并使用共聚焦显微镜监测其荧光随时间的变化。pHrodo™ Green在细胞外中性pH值下呈弱荧光或无荧光，但在囊泡从内体向溶酶体成熟过程中，随着pH值的下降，其荧光强度会逐渐增加。在最初的5分钟内，pHrodo™ Green-LDL在Zeb1^WT和Zeb1^ΔM巨噬细胞中的荧光水平相当。然而，10分钟后，Zeb1^ΔM巨噬细胞中的荧光显著增强，而在Zeb1^WT巨噬细胞中则保持相对稳定（图1）。这表明Zeb1^ΔM巨噬细胞内的LDL运输受到阻碍。

图1. Zeb1缺失阻碍巨噬细胞内的脂质运输^[1]

pHrodo™指示剂是什么

上述文献中提到pHrodo™染料在中性pH值时几乎不发荧光，而在酸性环境下可发出明亮的荧光，这种pH敏感性的特性使pHrodo™成为许多应用的理想pH指示剂。pHrodo™染料可用于检测细胞质或细胞亚结构内的pH。由于其在中性pH值下几乎不发荧光，并且任何未内化的的染料基本也不发荧光，因此省去了洗涤步骤和染料淬灭的必要。基于这种特殊的荧光特性，使得pHrodo™在各类吞噬等实验中有广泛应用。

除了pHrodo™ Green以外，我们也有其他颜色的pHrodo™基团（图2），可以适用于不同多色荧光共染。

图2. pHrodo™ Green、Red和Deep Red的荧光发射光谱

颗粒和蛋白经过细胞的内化作用进入囊泡，这些囊泡相对于细胞外环境而言是酸性的。利用pH敏感的荧光探针标记这些颗粒或蛋白，可以监测细胞摄取和内化的多种过程，并追踪从早期内体(pH 6.3)至溶酶体(pH 4.7)或再循环的整个过程，且无需淬灭或洗涤步骤。因此，在细胞吞噬能力的相关研究中，也能看到pHrodo™系列染料的应用。

吞噬作用

在正常细胞生命活动过程中，细胞会内化颗粒物质，如微生物，这一过程对于免疫反应和凋亡细胞清除过程非常重要。吞噬作用研究的指示剂包括BioParticles结合物，即荧光染料标记的处理过的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母聚糖A。不同的细胞上参与吞噬过程的受体不同，因此不同细胞类型对不同来源的Bioparticles的摄取存在显著差异。如图3所示，文章比较了原代巨噬细胞对不同类型的颗粒的摄取存在显著差异。尽管原代巨噬细胞对大肠杆菌、细菌和酵母颗粒的摄取均存在浓度依赖性，但对酵母颗粒，尤其是金黄色葡萄球菌的吞噬效率更高。

图3. 原代人类巨噬细胞对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和酵母聚糖A的吞噬作用^[2]

类似地，我们也可以通过影像的手段，追踪不同培养条件下，细胞吞噬能力的差异。有文章比较了Raw264.7细胞，在添加细胞外囊泡（bacteria‑released extracellular vesicles，BEVs）共培养后，能显著增强其吞噬能力（图4）。

图4. BEV对巨噬细胞吞噬作用的影响^[3]

内吞作用和胞饮作用

内吞作用是指细胞通过内吞蛋白质或多糖等非颗粒物质而将其内化的过程。该过程对于细胞代谢和细胞信号非常重要。荧光蛋白和有机染料是对囊泡壁和囊泡内容物进行染色的非常有用的指示剂。由于囊泡pH会在内吞过程中发生改变，因此，也可利用pH指示剂检测内吞作用和胞饮作用的整个进程。目前，追踪荧光标记的葡聚糖的内化是分析内吞作用的常规方法之一。细胞膜的张力与细胞的内吞能力呈现一定相关性，有文章比较了药物处理小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）24h后，细胞形态改变，细胞膜表面张力增大，细胞内吞能力也增强（图5）。

图5. 使用pHrodo™标记葡聚糖对内吞作用定量^[4]

配体内化与抗体内化

配体内化是一种受体介导的内吞过程，其中如果细胞与其细胞表面上的特定受体蛋白结合，则细胞只吸收细胞外分子。特异于细胞表面受体的抗体在结合时诱导受体介导的内吞作用通常被作为靶向传递治疗用药物、毒素、酶或DNA的载体进行研究。因此，pHrodo™也可用于标记特定配体蛋白或抗体，以研究目的蛋白或抗体的内化作用。

我们也有总结应用在抗体偶联药物/ADC领域，各类不同pHrodo标记试剂的差异与选择指南，请详细参考：【抗体偶联药物/ADC】筛选与鉴定工具汇总

参考文献

1. Martinez-Campanario, M. C., et al. “Atherosclerotic plaque development in mice is enhanced by myeloid ZEB1 downregulation.” Nature Communications 14.1 (2023): 8316.

2. Lindner, Benjamin, Tobias Burkard, and Michael Schuler. “Phagocytosis assays with different pH-sensitive fluorescent particles and various readouts.” Biotechniques 68.5 (2020): 245-250.

3. Zhu, Ruiyao, et al. “Probiotic bacteria-released extracellular vesicles enhance macrophage phagocytosis in polymicrobial sepsis by activating the FPR1/2 pathway.” Molecular Medicine 30.1 (2024): 216.

4. De Belly, Henry, et al. “Membrane tension gates ERK-mediated regulation of pluripotent cell fate.” Cell stem cell 28.2 (2021): 273-284.