高效液相色谱纯化：何时使用分析型、半制备型和制备型方法

你认为自己天生就是一个“准备者”吗？我喜欢提前准备，这样总能随时应对，而这首先需要拥有合适的工具。这一点在实验室中尤为重要，因为你需要从复杂溶液中分离出超纯化合物。在这篇博客文章中，我将解释三种HPLC纯化准备方法：分析型、半制备型和制备型——以及何时使用每一种方法。

如果你想从样品中分离某些组分或收集物进行纯化，其实你正在为下一步做准备，这意味着你正在进行制备型液相色谱（LC）操作。你的下一步可能是用于科研、质量控制或最终产品包装。在这些情况下，你都可以使用分析型、半制备型和制备型方法。

通常，你会在教材中看到，制备型LC主要涉及大型色谱柱、流速高于100 mL/min等。此外，它更偏向于简单的色谱过程，包括捕集、冲洗和洗脱。而分析型LC则被描述为具有更高压力和高分辨率、小颗粒及小粒径及小进样量。

我的亲爱的同事Tim几年前也曾这样比较过。但是在这里我想说，这种解释只部分正确。你不应该将制备型液相色谱（prep LC）——也就是大规模分离物质的工作流程——与需要分离的材料数量混淆。不管柱子的大小如何，你的目标始终是获得高产率和高纯度的纯化样品。

定义也可能因仪器制造商或应用市场而异。你可能会听到制备型液相色谱、半制备型液相色谱分析规模的制备型液相色谱等等。

因此，如果有人谈论制备型液相色谱，我建议深入了解分类背后的细节和动机。

有两件事决定了你选择用于纯化的制备型液相色谱方法的规模和类型：

你希望分离出的产品绝对产量当然取决于样品的可用性。如果你是在处理小规模蛋白消化物、少量合成分子探针，或者试图纯化大批量蛋白生产批次，这都会产生不同影响。

对于大批量蛋白生产批次，你很可能注入大量样品体积可以手动进行，甚至可以通过蠕动泵或手工填装色谱柱来实现。

在确定制备型液相色谱方法的规模时，你对分离或纯化的需求取决于应用领域。这个因素通常会导致你决定不提高流速来进行纯化。

原因可能是已经有了成熟的分析方法，无需进行方法放大，因此你只需要对组分进行简单净化，无需投入更多时间。无需调整已经优化好的梯度方法。例如，你可以重复纯化来自中试过程中的生物化合物目标分析物。

在其他情况下，为了将主峰与杂质分离，需要高纯度且高分辨率的纯化，否则样品无法使用。这些经过纯化的样品价值极高，需要采用小粒径UHPLC色谱柱，并以较低流速进行纯化。

瞧，你现在正在以分析流速进行制备规模的纯化操作。

这种应用领域的一个例子是：寡核苷酸链的纯化这需要对 n-1 聚合物进行超高分辨率纯化，以去除失败序列，从而确保其在 PCR 检测中的有效性。

现代仪器可以帮助您应对在纯化步骤中保持分析分辨率的挑战，例如通过采用智能技术的馏分收集器，如自动延迟体积、优化流体设计、最小化扩散和减少馏分间的残留。

例如，Thermo Scientific™ Vanquish™ 分析纯化液相色谱系统配合集成的 Thermo Scientific™ Vanquish 馏分收集器可用于寡核苷酸的半制备纯化

图 1. 寡核苷酸的半制备反相液相色谱纯化。流速为 5 mL/min，应用于内径为 10 mm 的色谱柱。进样体积为 500 µL。在这些条件下，我们能够将目标峰与杂质及目标峰的异构体分离出来。

您可以观看我与 Tiffany 的访谈，了解掌握 HPLC 纯化流程所需的重要因素。

您还可以进一步了解我们的 Vanquish 分析纯化液相色谱系统，以及我们现有的一系列相关资料来帮助您：

Bioprocessing Staff