理解 HPLC 系统：死体积、滞留体积与柱外体积

如果你曾经排查过 HPLC 故障问题，就会知道影响分离质量的因素多得惊人。更“添乱”的是，我们这些色谱人对术语的热爱，常常超过对一致性的追求。

理解 HPLC 系统相关的不同体积概念对方法开发、排查峰形不佳以及方法转移等非常关键。因此，我想花点时间澄清几个经常引起混淆的术语：HPLC 死体积、滞留体积以及柱外体积。

在讨论这些概念何时重要之前，先给出定义。

死体积（dead volume）——最常被（不正确地）当作“柱外体积”的替代说法。死体积实际上指“色谱系统中未被流动相冲刷（扫过）的体积”。

柱外体积（extra column volume）——HPLC 系统中从进样环到检测器之间、但不包括色谱柱本身的全部体积。死体积是其中的一部分。

滞留体积（dwell volume），也称梯度延迟体积（gradient delay volume），指从流动相混合点到色谱柱入口之间的体积。

HPLC方法转移现在我们可以利用这些定义，开始思考每个术语在何时重要。

HPLC死体积

可以把死体积理解为 LC 系统（不含色谱柱）中样品会接触到、但流动相并未被有效冲刷的各种“缝隙与角落”。

为什么这很重要？

死体积与分离效率密切相关，并且对峰宽和峰形有巨大影响。

先想象一个分析物在两段通过接头连接的管路中流动（1）。当进入接头时，溶液中的分析物会扩散开来填满更大的可用空间（2）。先不考虑复杂的流体力学，你可以把接头的角落想象成被流动相冲刷得更慢的区域——就像每个角落里有小漩涡。

随后当分析物进入下一段管路时，那些通过扩散或局部流动到达角落的部分，会更晚离开接头（3）。这种滞后最终导致一种峰不对称——峰拖尾（peak tailing），表现为峰前沿比峰后沿更浓（4）。此外，流路中增加任何体积都会因扩散而加剧带展宽——这一点会在柱外体积部分再次提到。 避免峰拖尾的最佳方式，是确保样品流路中的所有连接具有最小的死体积。为此，赛默飞Viper和赛默飞nanoViper指紧式接头配件几乎消除了死体积——避免峰形畸变并尽量减少峰宽。

高效液相色谱（HPLC）柱外体积

柱外体积分为两类：柱前体积和柱后体积。

柱前体积指从进样点到色谱柱入口之间样品流路的全部体积。柱前体积越大，分析物在到达柱头前扩散的时间越长，从而导致峰越宽。

虽然任何情况下都应尽量减小柱前体积，但其谱带展宽效应在等度分离中最为明显。因为等度分离无法享受梯度分离在柱头产生的聚焦效应，该效应能缓解部分柱前带展宽。

理解 HPLC 系统相关的不同体积概念，是成功进行方法开发与方法转移的关键。本指南将介绍你需要了解的 HPLC 死体积、滞留体积与柱外体积。

如果你已经理解了这些概念，应该能推断出柱后体积就是色谱柱出口之后的全部体积。无论是等度还是梯度分离，柱后体积都可能严重降低效率。简单说：柱后体积越大，分析物带在检测前扩散的时间越长，分辨率损失越多。正如前面所说，由于这段体积发生在分离之后，梯度聚焦效应也帮不上忙。

随着流速降低、色谱柱内径（ID）减小，柱前与柱后体积对分离的负面影响会越来越大。好在解决方法很直接：缩短管路长度、消除连接不良导致的死体积，并根据柱尺寸选择合适内径的管路。对特定 HPLC 系统而言，尽可能选择更短、更小内径的管路，可限制柱外带展宽，保住辛苦获得的峰分辨率。

需谨记：背压与管路半径的平方成反比。故若将管路内径减半，维持相同流速所需压力将增至四倍。

HPLC滞留体积/梯度延迟体积

梯度延迟体积（GDV）可能是三个概念里最直观的。它包括从流动相混合点到色谱柱入口之间的总容积，涵盖但不限于泵头、管路、混合器、进样环以及流路中的各类阀。对于一定流速，GDV 可换算为泵端流动相组成变化到达柱入口所需的时间。

如果你只关心等度分离，可以跳过本节。因为流动相组成恒定，泵与柱之间不存在“延迟”。

泵的类型是决定系统 GDV 的关键因素。按梯度形成方式，泵可分为低压梯度泵与高压梯度泵；低压梯度泵对 GDV 的贡献更大。

• 在低压梯度泵中，流动相在低压下、到达泵头之前就完成混合。比例阀、泵入口管路以及泵头的体积都会计入 GDV。在低压梯度泵中，泵本身往往是 GDV 的主要来源。多数四元泵采用低压梯度形成方式。
• 高压梯度泵具有多个泵头（每种溶剂一个），混合发生在泵头之后。因此泵头与入口管路不计入 GDV。高压梯度泵通常只占总 GDV 的较小部分。二元泵往往属于这一类。

虽然已知 GDV 会影响分析物选择性，但其两大主要影响体现在通量与方法转移上。² 首先，在梯度到达柱头前，会出现一段初始等度过程；这段等度保持是限制方法通量的主要因素之一。

在 HPLC 系统间进行方法转移时，了解各系统的 GDV 对获得可比结果、避免不必要的方法验证至关重要。如前所述，GDV 的显著差异会影响峰形、选择性与保留时间。

GDV 不仅决定绝对保留时间，也会影响梯度曲线。下图所示的梯度曲线“平滑化”（与分析物带展宽是同一过程）在尝试匹配峰形与洗脱顺序时可能是重要因素。复杂梯度（比如多阶梯度）在 GDV 不匹配的系统上更难复现。幸运的是，有多种资源可以简化方法向Thermo Scientific Vanquish HPLC和UHPLC系统的转移。例如，可以实现可调节GDV的方法转移套件。

实用链接

简化方法转移
白皮书：成功进行(U)HPLC方法转移的仪器参数指南

参考来源

1. IUPAC. Compendium of Chemical Terminology, 2nd ed. (the “Gold Book”). Compiled by A. D. McNaught and A. Wilkinson. Blackwell Scientific Publications, Oxford (1997). Online version (2019-)
2. Schellinger, AP; Carr, PW. A Practical Approach to Transferring Linear Gradient Elution Methods. J. Chromatogr. A, 2005, 1077(2), 110-119