成功提取RNA的14个技巧

即便是经验最丰富的分子生物学家，在RNA提取过程中也难免会有情绪失控的时刻。在外人看来，这位可怜的科研人员仿佛正对着一个装满透明液体的普通试管大发雷霆，显得颇为失态。

然而，对于那些亲历过RNA提取种种波折的科研工作者而言，这种情绪宣泄（被戏称为“RNA怒”）却极易引发共鸣。事实上，因RNA实验而情绪失控是一种自然而普遍的现象——毕竟，即便是资深专家，也难逃提取效率低下或RNA意外降解的窘境。

但对于那些经历过RNA提取各种痛苦的科学家来说，很容易产生共鸣。愤怒的爆发（也被称为RNA愤怒）是从事RNA工作时自然且常见的副作用。这很容易理解：低提取产量和降解的RNA即使对资深科学家也可能发生。

获得高质量样本类型中的RNA已经成为许多实验方案中的基础环节，包括下一代测序（NGS）、实时荧光定量PCR(qPCR)、Northern杂交和cDNA合成，许多科学家都在日常操作中进行。如果RNA质量较低，会显著影响后续分析，导致时间和金钱损失。

其实并不一定要如此。许多RNA提取问题都是可以避免和解决的。为了助力你在RNA提取之路上取得胜利，我们准备了14条建议，帮你将“RNA愤怒”转化为“RNA智慧”。

选择合适的RNA纯化试剂盒

市面上有很多用于RNA提取的试剂盒和试剂。但某些方案或形式可能更适合你的目标。在选择前请务必对每种试剂盒进行仔细研究或试剂，并考虑您将从哪种样本中提取RNA、该样本的起始量、下游分析方法、所需通量以及您要分析的RNA类型。

例如，如果您需要一种用于总RNA高通量纯化的方法，那么您可能会考虑可扩展的MagMAX™ 试剂盒而不是TRIzol RNA提取法。但如果您的样本数量较少，并且希望采用金标准方法以获得高质量RNA，您很可能每次都会选择TRIzol。

注意输入量

多并不总是更好。大多数RNA分离试剂盒和试剂都为特定样本类型提供了推荐的起始材料用量。添加超过推荐量可能会抑制有效裂解或阻碍RNA与其他细胞成分的分离。对于柱式操作流程，您可能会超载柱子的结合能力，从而降低整体产率。

请注意，不同动物组织中的RNA含量可能有显著差异：心脏和肌肉细胞的总RNA含量低于富含核酸的脾脏和胸腺细胞。这些组织还可能引入额外的干扰因素这些因素可能会使提取过程变得复杂，因此可能需要对操作流程进行调整，以获得高质量的RNA。

创建无RNA酶环境

RNA酶？你从没听说过吧？

它们是你提取RNA时最大的敌人。它们很难被灭活或去除。RNase A家族中的RNA酶通过多个二硫键稳定，即使在变性后，仍能保持活性，即使已经变性后也能保持活性。^1,2

为了减少在提取RNA过程中意外引入RNA酶，请建立一个无RNA酶的实验台专用区域。这个区域可以是你的实验台的一部分，用胶带标记，与DNA或蛋白质提取区分开。在这个区域内，专门存放用于RNA提取工作的试剂、耗材、移液器和手套。

穿戴个人防护装备

你是RNase的主要来源。你的汗液和皮肤油脂是RNase污染的丰富来源。因此，戴手套以防止手部污染至关重要。如果你用正在佩戴的手套接触了可能含有RNase的表面（如门把手、你的脸或你在上述创建的无RNA酶区之外的其他表面），请务必更换手套。你也可以穿上实验服，以确保身体其他部位不会接触到样品。

使用无RNA酶试剂和耗材

与上述观点一致，你还可以购买清洁产品、耗材及其他试剂，以帮助控制RNase，确保它们不会靠近你的RNA。表面去污溶液可以帮助去除玻璃器皿、实验台和移液器上的RNase。

你可能认为所有管子和移液器吸头在出厂时都是无RNA酶的，但许多产品在制造过程中可能已被引入了RNase。请确保你的耗材经过无RNA酶认证，并且使用带过滤芯的吸头，以防止移液器吸头或样品间交叉污染。

进行预实验（Pilot Experiment）

在开始实验之前，你可能没有意识到某个步骤会让你的RNA暴露于RNase污染，或者你计划使用的试剂盒并不适合你的样本类型，直到你开始实际操作时才发现这一点。RNA提取。为了防止浪费您宝贵的样本，建议先用价值较低的样本进行预实验，这样可以优化您的RNA提取方案，避免后续因操作不当而造成昂贵的返工或需要重新收集样本。

稳定您的RNA

RNA的生化特性使其本质上不稳定，并且某些RNA具有较短的半衰期^5,6。为了确保不会对下游分析产生偏差，您需要在样本采集后尽快破坏所有内源性RNase。您可以通过使用TRIzol或我们的裂解缓冲液来裂解细胞，从而实现这一点。TRIzol或来自我们的裂解缓冲液PureLink™ RNA Mini Kit  并将样本冷冻在-80°C以便后续处理。您也可以在裂解缓冲液重悬后立即提取RNA。或者，将样本快速冷冻于液氮中，可以防止样本采集后RNA的降解。

如果您不想处理液氮带来的麻烦，可以使用RNA稳定剂，例如RNAlater。它可以立即灭活RNase，让您能够灵活选择合适的时间提取RNA，而无需担心RNA降解问题。

添加机械或酶促裂解步骤

FFPE样本（石蜡包埋组织），血液样本，以及某些微生物，通常很难提取到足够量且高质量的RNA，因此可能需要额外步骤以确保完全裂解。这些步骤包括使用珠磨法进行机械裂解，或用溶菌酶、蛋白酶K进行酶预处理。如前所述，裂解不完全可能导致基于柱的提取方法出现下游问题。在从难以处理的样品中提取RNA之前，请仔细查阅操作流程，确认是否包含针对特殊样品的具体步骤。

保持低温

RNA的不稳定性使得在整个处理过程中保持样品低温变得至关重要。如果你以前遇到过RNase相关的问题，可以考虑让提取溶液保持低温，在冷室中进行提取，或者在离心步骤中使用预冷的离心机。

去除DNA污染

大多数RNA分离试剂盒和试剂都能有效去除污染的基因组或质粒DNA。但某些后续定量方法，如NanoDrop，或应用，如qPCR，即使是极微量的DNA也能被检测到，从而使分析变得复杂。

为了解决这个问题，许多基于柱子的纯化方法都包含了DNase I，例如PureLink™ DNase Set（PureLink™ DNase套装），可用于柱上处理。你也可以在提取后使用DNase I进行消化。

RNA定量与质量控制检测

有几种方法可以对纯化后的RNA进行质量控制并获得准确的定量结果。你可以利用紫外吸收法，在260nm波长下测核酸、280nm波长下测蛋白污染、230nm波长下测其他杂质（如异硫氰酸胍）。通过观察A260/A280比值（目标范围1.8-2.2）和A260/A230比值（目标>1.7），可以评估RNA的纯度。

荧光计，例如Qubit荧光计，也可以定量RNA，并且比基于紫外吸收的方法更为灵敏。基于微流控的方法同样有助于RNA的定量和质量判断。样品会用荧光染料标记，并通过凝胶矩阵进行电泳。不同的RNA种类会根据大小在矩阵中迁移，通过观察完整的荧光轨迹可以估算RNA的完整性。该方法能够检测DNA污染物或RNA降解产物，并将其转化为一个1到10的RNA完整性数值（RIN），其中10代表最佳的RNA完整性。

储存纯化后的RNA

许多柱式或磁珠式试剂盒都提供无RNase的洗脱缓冲液，可以长期保护RNA的完整性。对于TRIzol RNA提取，你可以将干燥沉淀重悬于无RNase水或其他专用储存溶液中。定量后，将你的RNA分装到一次性使用的小管中，以减少冻融循环（可能导致降解）或意外RNase污染。如果短期内需要使用，可储存在-20°C；如需长期保存，则应储存在-80°C。

自动化你的提取过程

市面上有多种可用于自动化提取和纯化系统（包括前文提到的MagMAX试剂盒）的RNA提取试剂盒，如KingFisher™系统。自动化有助于避免RNA提取过程中最主要的问题之一——因人工操作导致的RNase污染。同时，它还能实现可重复性的RNA纯化，并且相比手动样品制备，能将实际操作时间减少75%。

让你的每一步RNA提取都尽善尽美

寻求帮助

有些问题太大，无法单靠自己解决。如果您在RNA提取方面需要额外的支持和帮助，请访问我们的RNA样本收集、保护与分离支持中心。这里有指南、基础教程、故障排除技巧、培训以及更多资源，帮助您顺利完成RNA提取。

为了让您继续学习，我们还提供了其他在线资源：

• RNA参考指南
• RNA分离操作注意事项与禁忌事项
• PureLink试剂盒与Qiagen试剂盒应用说明书

本文仅供科研使用，不适用于诊断程序。

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参考文献

1. RNA操作基础。Thermo Fisher Scientific 网站：https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https%3A%2F%2Fassets.thermofisher.com%2FTFS-Assets%2FBID%2FTechnical-Notes%2Frnasezap-rnase-decontamination-solution-tech-note.pdf&title=VGVjaCBOb3RlOiBSTmFzZVphcCBSTmFzZSBEZWNvbnRhbWluYXRpb24gU29sdXRpb24uIFdvcmtpbmcgd2l0aCBSTkE6IHRoZSBiYXNpY3M=。发表于2019年5月2日。访问日期：2021年7月26日。
2. Klink TA, Woycechowsky KJ, Taylor KM, Raines RT. 二硫键对核糖核酸酶A构象稳定性和催化活性的贡献。欧洲生物化学杂志，2000；267:566-572。
3. Gupta SK, Haigh BJ, Griffin FJ, Wheeler TT. 哺乳动物分泌型RNases：宿主防御中的作用机制。《先天免疫》，2013；19:86-97。
4. 4.Zasloff M. 人体皮肤的抗菌RNases。《皮肤病学研究杂志》，2009；129:2091-2093。
5. RNA。EMBL-EBI 网站：https://www.ebi.ac.uk/training/online/courses/biomacromolecular-structures/rna/。访问日期：2021年7月28日。
6. 6.Sharova LV、Sharov AA、Nedorezov T、Piao Y、Shaik N、Ko MS。通过对多能性和分化中的小鼠胚胎干细胞进行DNA微阵列分析，获得了19,977个基因的mRNA半衰期数据库。DNA Res. 2009