PVDF与硝酸纤维素膜（NC）？如何选择印迹膜？

对于任何设计或排查蛋白印迹（western blot）实验的人来说，“PVDF还是硝酸纤维素？”这个问题可能不会像抗体选择、转膜方式或检测方法那样被优先考虑。

但转膜材料的选择会对灵敏度、动态范围和整体结果质量产生巨大影响。这是一个值得你认真思考的步骤——尤其是当你打算投稿期刊时。

在本指南中，我们将重点介绍如何为你的蛋白印迹实验选择（并处理）优质的转膜材料。

如何选择PVDF或硝酸纤维素等转膜材料

Western转膜膜在蛋白质印迹（Western blot）中至关重要，因为它们在电泳分离后为蛋白质提供了一个稳定的固定平台。一旦蛋白质从凝胶转移到膜上，研究人员就可以使用特异性抗体来检测和定量目标蛋白。

这些膜经过特殊设计，具有高蛋白结合能力，并且兼容多种检测方法，如化学发光、荧光和比色分析，从而最终提升了分析的灵敏度和准确性。

在Western blot实验中，主要有两种转膜选择：PVDF和硝酸纤维素。这两种材料在许多目标蛋白上都能产生类似且可靠的结果，但每种材料在特定情况下各有独特优势。

那么，该如何选择呢？

最佳转膜材料可能取决于你的目标蛋白

硝酸纤维素和PVDF对大多数蛋白质都具有很强的结合亲和力，通常使用任一类型的膜都能获得相似的结果（见图1）。然而，在某些情况下，特定目标蛋白可能具有某些化学性质（如疏水性），这会与其中一种膜的结合机制更为匹配，从而导致该类型膜对该蛋白表现出更高的亲和力，也就是对这种膜表现出明显偏好。

在这些情况下，选择哪种膜可能会显著影响Western blot的结果。如果蛋白与膜之间相互作用较差，可能会导致在孵育或洗涤步骤中蛋白从膜上脱落。在严重时甚至可能完全无法将蛋白固定到膜上。如果你难以检测到目标蛋白，不妨尝试更换另一种类型的转膜作为起点。

检测方法也很重要——化学发光还是荧光？

PVDF和硝酸纤维素膜在化学发光应用中表现相似。对于荧光检测方法然而，不同类型的膜在关键性能方面存在差异，这可能会影响您的选择。低荧光PVDF是一种多用途选项，适用于所有检测方法，但在荧光检测中表现尤为出色。

有些用户可能也对膜的操作有偏好。

膜的易操作性对于希望减少工艺步骤和实际操作时间的用户来说可能是一个重要因素。有些膜在使用前需要激活步骤，以确保最佳结合效果。耐用性对于需要多次剥离和重复探测印迹的用户来说也很重要。

PVDF和硝酸纤维素转膜在合适的条件下都可以成为有效的蛋白免疫印迹工具。让我们来深入了解每种膜类型的优缺点。

硝酸纤维素膜的优缺点

Harry Towbin在1979年首次开发蛋白免疫印迹技术时使用了硝酸纤维素膜，这一方法至今仍是广泛发表的标准。

硝化纤维素膜通过硝化反应制备，即纤维素与硝酸和硫酸反应——将羟基替换为硝基。通过氢键、氮偶极、离子和疏水相互作用，这些膜能够结合并固定多种蛋白质。

优点

1. 适用于多种类型的蛋白质
2. 蛋白转移无需激活步骤

缺点

1. 在操作过程中比PVDF更容易撕裂
2. 不兼容某些溶剂或强酸性条件
3. 由于易燃性，在某些地区受到更严格的管控
4. 由于自发荧光，尤其是在较短波长下，对荧光免疫印迹实验来说并非最佳选择。

PVDF膜的优缺点

聚偏二氟乙烯（PVDF）膜可以制造为偏二氟乙烯的均聚物，也可以与其他添加剂共聚。这使得膜具有坚固且稳定的特性，并通过疏水相互作用结合蛋白质。此外，PVDF膜在物理和化学上都非常稳定，易于操作，并且兼容大多数免疫印迹实验流程。这些特性使得PVDF成为许多研究人员青睐的可靠选择。

然而，与硝酸纤维素不同，PVDF膜在使用前必须进行活化。虽然只需短暂处理，但这意味着在本已耗时的免疫印迹实验中又增加了一步。

优点

1. 适用于多种类型的蛋白质
2. 物理和化学性质稳定，不易撕裂

缺点

1. 使用前需要激活/润湿步骤，需用甲醇或乙醇溶液处理。
2. 自发荧光水平高于硝酸纤维素，这会严重影响可用的荧光通道、检测限和荧光实验过程中的准确性。

低荧光PVDF膜的优缺点

低荧光PVDF膜常用于荧光蛋白印迹或配合全蛋白定量的荧光归一化方法，以最大化信噪比。

它们旨在减少自发荧光来源——如原材料和杂质——因此相比硝酸纤维素和标准PVDF膜具有更低的荧光背景（见图3）。

除了提高灵敏度之外，更低的荧光背景还使得可以使用更广泛的荧光成像通道，从而让研究人员能够通过多重检测从每一张蛋白质印迹膜中提取显著更多的信息。最后，许多低荧光PVDF膜在化学发光应用中的表现与标准PVDF膜相似，使其成为最具多功能性的膜选项。

优点

1. 适用于多种类型的蛋白质
2. 在化学发光应用中表现与标准PVDF膜相似
3. 专为降低自体荧光而设计，非常适合用于荧光检测

缺点

1. 使用前需要激活/润湿步骤，需用甲醇或乙醇溶液处理。

PVDF 还是硝酸纤维素：哪种更好？

总之，硝酸纤维素膜和PVDF膜都适用于蛋白质印迹（western blot），但各自具有不同的优点和缺点。

• 硝酸纤维素膜无需激活，但更容易撕裂。
• PVDF膜虽然需要激活，但具有高度耐用性和良好的化学兼容性。
• 低荧光PVDF是最具多功能性的膜选项，在所有检测方法中表现出色，尤其在荧光检测方面性能卓越。

虽然确定针对特定目标蛋白的最佳膜类型的最有效方法是测试蛋白在每种膜上的结合情况，但这过程既繁琐又耗时。因此，如果耐用性和多功能性是首要考虑因素——特别是在荧光检测方面——低荧光PVDF膜通常是最佳选择。

下表总结了硝酸纤维素、PVDF及低荧光PVDF膜之间的主要区别。

属性	硝酸纤维素	PVDF	低荧光PVDF
化学发光检测	+++	+++	+++
荧光检测	++	+	+++
总蛋白归一化	++	+	+++
需要激活吗？	否	是	是
结合机制	氮偶极、氢键、离子和疏水相互作用	疏水相互作用	疏水相互作用

关于 PVDF 和硝酸纤维素膜的常见问题

我们的研发专家在下方分享了他们对研究人员最常提出的一些膜相关问题的回答。

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转膜后如何保存蛋白印迹膜：硝酸纤维素和 PVDF 的保存方法有区别吗？

理想情况下，转印后应立即进行免疫检测。但如果需要将膜保存以便之后进行免疫探针实验，建议采取以下步骤：

• 冲洗：用蒸馏水快速冲洗膜，以去除残留的转印缓冲液。
• 干燥：将膜片放在干净的滤纸上，并让其完全自然风干。硝酸纤维素膜和PVDF膜在干燥状态下非常稳定，可以长期保存。
• 储存：将干燥后的膜片储存在干净、干燥的容器中，或夹在滤纸之间，置于室温下。确保膜片保持平整，以避免出现折痕。

干燥的PVDF膜在封闭和用一抗孵育前需要先用100%甲醇或乙醇重新水化。

硝酸纤维素膜和 PVDF 膜在活化步骤上有哪些不同？

PVDF膜需要通过浸泡在100%甲醇或乙醇中3分钟进行预活化，然后快速用去离子水冲洗2在使用前需要进行激活步骤。这一步是必要的，因为PVDF具有高度疏水性，导致其难以与水发生相互作用。

在激活步骤中，甲醇或乙醇作为润湿剂，打破非极性膜与极性缓冲液之间的表面张力，使它们能够相互作用。甲醇还可以增强膜的疏水作用，使转移的蛋白质能够紧密结合到膜上。

相比之下，硝酸纤维素膜通常只需在缓冲液或水中简单润湿即可使用，无需甲醇处理。这些差异意味着PVDF膜需要额外的激活步骤，而硝酸纤维素膜则更容易准备。

如果 PVDF 膜干了会发生什么？

如果PVDF膜在封闭之前干燥，可以按照上述方法重新水化，然后再进行封闭步骤。一般来说，这不会影响蛋白质结合。建议避免在化学发光底物检测前立即干燥。如果采用荧光检测方法，大多数印迹通常可以直接干燥成像而无需重新润湿，但某些荧光染料容易降解，而这种降解会因膜干燥而加速。

我有 iBlot 3 或 iBlot 2 胶转移仪。需要使用哪种类型的膜？

iBlot 3系统用于蛋白转移时可使用硝酸纤维素、PVDF和低荧光PVDF膜，而iBlot 2仅使用硝酸纤维素和PVDF。iBlot转移堆叠将这些膜直接集成于堆叠中或单独包装，以最大程度提供便利，同时保持优异的转移效率。

PVDF 和硝酸纤维素的转膜时间有区别吗？

一般情况下，在标准条件下，PVDF和硝酸纤维素膜的转移时间相似。然而，根据蛋白质大小、凝胶组成以及转移设备等因素，可能需要对操作流程做出微调。

关于 PVDF 和硝酸纤维素膜的更多资源

您可以在 thermofisher.com 了解更多关于蛋白质印迹转膜流程及相关内容：

• 概述：蛋白质印迹转膜方法
• 应用说明 –基础荧光蛋白质印迹技术与多重检测
• 概述：荧光蛋白质印迹技术

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