HILIC 和 ACN 出现问题？如何稳定您的 HPLC 操作

亲水相互作用液相色谱（HILIC）因其在代谢组学领域的重要性不断提升，已成为质谱联用分离极性组分的热门方法。

乙腈（ACN）由于其相较于甲醇等有机溶剂具有更低的黏度，可能是 HPLC 中最常用的有机溶剂之一。虽然乙腈非常适合防止由于流动相黏度变化导致的柱和系统损坏——尤其是在梯度分离过程中产生的背压增加——但这种溶剂也存在一些已知问题，如颗粒污染和聚合反应。

如果你在HILIC分离中使用乙腈遇到困难，请放心，有几种方法可以帮助你排查并快速解决这些问题。

乙腈，高效液相色谱中的完美有机溶剂？

乙腈，又称甲基氰，是高效液相色谱所需的重要化学性质的理想选择。

• 乙腈比甲醇具有更强的洗脱能力，可与水完全混溶，并且与水混合时能产生较低的背压。

• ACN在低波长（<250nm）下几乎没有紫外吸收，并且可与含有芳香族化合物（如酪氨酸和苯甲酸）的溶液兼容。

• ACN是生产丙烯腈过程中的一种工业副产物，因此这种化合物广泛供应且价格低廉。

使用ACN进行高效液相色谱（HPLC）时可能遇到的常见问题

尽管ACN听起来像是HPLC的理想溶剂，但仍存在一些缺陷。

首先，紫外透明度取决于所用ACN的纯度/质量。根据具体需求，市面上有多种不同等级的ACN可供HPLC和LC-MS分析使用。不幸的是，这些不同的分类标准在各供应商之间并未统一，导致质量差异显著，从而影响仪器性能甚至加剧仪器磨损。

如前所述，ACN是一种工业副产物，需要经过纯化和过滤以去除来源中的大量颗粒污染。因此，过滤质量至关重要，以防止微小颗粒引起HPLC泵单向阀泄漏或增加活塞及密封件的磨损。

另一个经常被讨论的现象是所谓的聚合反应（polymerization）。有文献指出，在极端条件下或强酸存在时（这些情况不会出现在您的HPLC系统中），ACN可能发生聚合反应。

值得注意的是，ACN通道上的单向阀粘滞问题是一个众所周知的问题，其描述见于：John Dolan于2008年发表的文献中。

如何减轻与ACN相关的HPLC分析问题

遵循HPLC系统的最佳实践是避免意外停机的良好起点：

1. 保持您的HPLC仪器（及其组件）清洁

就像水随着时间推移会发生生物污染一样，乙腈（ACN）在长期使用过程中也可能积累污染物。因此，请每4-6周进行一次使用合适且干净的洗涤溶剂（如异丙醇IPA或与水混合）的系统清洗（sanitization）。

最佳做法包括从溶剂储存瓶、通过泵到自动进样器，冲洗整个流体路径。设置自动冲洗程序还可以在序列之间实现更频繁的清洁周期。

此外，HPLC溶剂瓶暴露在日光下可能会加速生物污染的增长。在这种情况下，可以为瓶子使用合适的遮光罩，如用铝箔包裹，或者改用棕色试剂瓶（琥珀色瓶）。

2. 使用高质量溶剂以帮助防止您的HPLC系统受到污染

使用具有高过滤质量（<0.2微米）的LC-MS级溶剂有助于防止颗粒进入系统。没错，高质量溶剂比普通溶剂更昂贵，但请考虑因生产效率损失和相关成本带来的影响您的LC系统的过度停机时间。

请注意，HPLC储液瓶内的流动相过滤器无法防护亚微米级颗粒污染物。这些过滤器的典型孔径仅为10-20微米，主要用于防止较大颗粒进入系统并造成严重损坏。

• 小型亚微米颗粒会导致止回阀泄漏、内部过滤器堵塞以及活塞和高压密封件的严重磨损。

常规添加剂，如甲酸(FA)或三氟乙酸（TFA），应像溶剂一样谨慎对待。一个已经反复开启几十次的大容量旧储液瓶可能并不适合用于高质量溶剂。

• 理想情况下，应购买合适规格的小包装，例如安瓿瓶。

3. 考虑玻璃器皿的洁净度

在更换洗脱液瓶时，养成瓶子空了就更换的习惯，以防止污染物在瓶内积累。在使用之前，用干净的流动相冲洗瓶子，以清除任何残留物。

在更换瓶子时，带有溶剂管线的瓶盖应该放在哪里？建议将瓶盖组件直接从空瓶转移到新的瓶子上，避免额外污染。。

你还应定期用光照检查流动相瓶中的内容，并轻轻摇动瓶子，以发现流动相中漂浮的灰尘和污垢。

4.不要让泵长时间（过夜）浸泡在乙腈（ACN）中。

几天不打算使用你的HPLC？没问题。你可以将系统设置为待机模式，降低流速至50µL/min，或者完全关闭仪器。.

如果选择关闭仪器，在关泵前请用合适的溶剂如异丙醇（IPA）冲洗泵。如果泵长时间浸泡在乙腈中，单向阀球可能会粘附在阀座上，导致液体无法正常吸入。虽然堵塞的阀门可以重新工作，但修复需要将单向阀从泵模块拆卸下来。

如果你的仪器需要重新启动快速地，建议在低流速下保持待机状态。

5.避免将氢氧化铵添加剂与纯ACN混合

在碱性洗脱条件下，常见的HILIC流动相包含氢氧化铵（NH₄OH）/ACN。这种特定的流动相可能会加速您HPLC泵中的标准高压密封件的老化。在ACN相中加入低比例（约5%）的水是减缓损坏的有效方法。由于HILIC通常本身含较高水比例，可以提前将水预混入ACN流动相中。

如果无法适应洗脱液，请考虑更换柱塞密封。例如，您可以将标准UHMW-PE（超高分子量聚乙烯）密封件替换为石墨填充PTFE（聚四氟乙烯）密封件，这种PTFE密封件不会受到NH₄OH/ACN流动相的影响。

请注意，PTFE密封件适用于最高700 bar，并且可以放心使用，因为HILIC应用通常在较低压力下运行。

重要提示：由于DLC（类金刚石碳）涂层的原因，Vanquish Horizon UHPLC系统活塞时，绝对不能使用石墨化的特氟龙密封圈！

6. 解决与低背压相关的仪器问题

液相色谱系统中的泵单向阀通常是被动元件，需要足够的压力差以确保陶瓷球能够关闭流路且无泄漏。

虽然许多HILIC应用仅产生约100bar（1,500 psi）的背压，但最先进的(U)HPLC系统具有更高的压力极限能力。因此，这些系统及其关键部件，如单向阀，将在非理想工作压力以下运行。

较低的操作压力可能不足以确保单向阀完全密封，或无法进行依靠压力驱动的密封清洁。一个简单的方法是在泵模块和自动进样器之间加入一根小内径毛细管。这种调整会增加泵端的背压，从而实现更好的工作状态，而HILIC色谱柱所承受的压力不会受到影响。

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在我们的资料中了解更多关于HILIC应用的背景信息：HILIC分离技术指南以及HILIC学习中心.

您可以在我们的技术说明中学习监测溶剂质量的方法.

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