Phire Hot Start II DNA Polymerase 实现 21 分钟快速端点 PCR 扩增

聚合酶链式反应（PCR）是分子生物学领域中应用最广泛的基础技术之一，在基因分型、克隆构建以及病原相关研究等方面发挥着核心作用。随着样本通量和检测需求的不断提升，传统需要近 1 小时甚至更长时间的 PCR 程序已难以满足对结果“快速可得”的要求。

Thermo Scientific™ Phire™ Hot Start II DNA Polymerase 专为快速 PCR 而设计，相比常规 Taq 聚合酶，可在更短时间内完成扩增，整体运行时间缩短超过一半，并借助 Affibody™ 介导的热启动机制显著提升特异性。本技术说明展示了该酶在 100 bp–4 kb 不同长度片段端点 PCR 中的表现，证明其可在约 21 分钟内获得可靠扩增结果，为时间敏感型科研项目提供高效解决方案。

在以下场景中，PCR 扩增时间往往成为整体工作流程的瓶颈：

• 需处理大量样本的基因分型或克隆筛选
• 多位点、多片段的构建与验证
• 病原相关基础研究中的快速预筛或结果确认（限科研用途）

实现真正意义上的“快速 PCR”，不仅需要缩短每个循环步骤的时间，更要求在压缩时间的同时维持：

• 扩增产量与灵敏度
• 特异性（避免非特异性条带和引物二聚体）
• 对多种模板（基因组 DNA、质粒 DNA 等）的兼容性

Phire Hot Start II DNA Polymerase 通过优化酶学特性、缓冲体系和热启动技术，在上述维度取得平衡，从而支持真正可落地的快速端点 PCR 方案。

主要试剂与耗材

1. DNA 扩增相关试剂
   • Thermo Scientific™ Phire™ Hot Start II DNA Polymerase（Cat. No. F122S）
   • Invitrogen™ dNTP Mix（10 mM each，Cat. No. 18427088）
   • Invitrogen™ Nuclease-Free Water（非 DEPC 处理，Cat. No. AM9938）
   • 正向、反向引物：按照常规 PCR 引物设计原则合成
   • 模板 DNA：
     • pBR322 质粒 DNA
     • E. coli 基因组 DNA
     • 人基因组 DNA
   • PCR 仪：Applied Biosystems™ ProFlex™ PCR System，3 × 32 孔模块（Cat. No. 4484073），升温速率设置为 6°C/s
2. Amplicon 分析相关耗材
   • Invitrogen™ E-Gel™ Sample Loading Buffer, 1X（Cat. No. 10482055）
   • Invitrogen™ E-Gel™ 1 Kb Plus Express DNA Ladder（Cat. No. 10488091）
   • Invitrogen™ E-Gel™ EX Agarose Gels, 2%（Cat. No. G401002），用于 ≤0.5 kb 片段
   • Invitrogen™ E-Gel™ EX Agarose Gels, 1%（Cat. No. G401001），用于 1–4 kb 片段
   • Invitrogen™ E-Gel™ Power Snap Plus Electrophoresis System（Cat. No. G9101）

重要使用提示：

• 引物退火温度应使用在线 Tm 计算工具（thermofisher.com/tmcalculator）进行计算；
• 可适当提高热循环仪 ramp rate（升降温速率），以进一步缩短整体程序时间；
• 对小片段扩增产物，建议使用高百分比 E-Gel 凝胶进行电泳分析；
• 样品上样前需适当稀释后再进行 E-Gel 电泳。

推荐 20 µL 反应体系组成

操作建议：

• 可在冰上配制除模板外的主反应混合液，按样本数 n+1 的体积统一预混，以减少移液误差并提升重复性。

快速循环程序设置

• 初始变性：98°C 30 s，1 个循环；
• 每循环：98°C 5 s 变性；退火温度 X°C 5 s（根据 Tm 计算）；延伸 72°C：对 <1 kb 片段为 4 s/kb，对 ≥1 kb 片段为 8 s/kb；共 30 个循环；
• 末次延伸：72°C 1 min；
• 4°C 保温。
  表注说明：Phire Hot Start II DNA Polymerase 的最佳退火温度可能与基于 Taq 的聚合酶显著不同，建议使用 Tm 计算器优化退火温度。】

要点归纳：

• 初始变性和每循环变性时间均明显短于传统程序，有助于压缩总时间；
• 延伸时间根据片段长度分两档设置，确保不同长度目标在快速条件下仍能充分延伸；
• 退火温度需基于 Phire 体系专用 Tm 计算结果设定，其数值通常高于传统 Taq 体系。

在以下科研场景中，Phire Hot Start II DNA Polymerase 的快速端点 PCR 能力可提供显著优势：

• 高通量基因分型与克隆筛选
  大量样本的 PCR 预筛选往往是整体流程的“瓶颈步骤”。快速扩增可有效压缩每一轮筛选的时间，使从 PCR 到电泳判读的流程在短时间内完成。
• 病原相关基础研究与快速验证（仅限科研用途）
  针对细菌或其他病原相关靶标的扩增，可在短时间内获得结果，为后续测序、克隆或功能分析提供快速初步判断。
• 大片段或多片段构建验证
  对 1–4 kb 片段的快速扩增有助于加快克隆载体构建、突变引入后片段验证等流程，提高项目迭代速度。
• 多种模板来源下的统一 PCR 平台
  由于 Phire Hot Start II DNA Polymerase 在人基因组 DNA、E. coli 基因组 DNA 与质粒 DNA 上均表现出稳定扩增性能，实验室可基于统一体系完成多种样本类型的扩增。

• 显著加速端点 PCR 扩增
  通过优化循环程序，结果可在约 21 分钟内获得（具体取决于目标片段长度），相较传统 Taq 聚合酶的标准程序，整体时间大幅缩短。
• Affibody 介导的热启动机制
  热启动技术在低温条件下抑制酶活性，减少非特异性扩增与引物二聚体形成，可在室温下安心配制反应体系，提升特异性与灵敏度。
• 适配快速升降温热循环仪
  实验中采用 6°C/s ramp rate 的 ProFlex PCR System，充分发挥酶在快速温控条件下的性能，适合现代快速 PCR 平台。
• 广泛模板兼容性
  可稳定扩增来自人基因组、E. coli 基因组以及质粒 DNA 的目标片段，为多种模型系统提供统一解决方案。
• 与 E-Gel 电泳平台高度兼容
  配套的 E-Gel EX 凝胶和 Power Snap Plus 成像系统可进一步缩短从扩增到结果判读的总时间，适合需要快速周转的 PCR–电泳工作流程。

本技术说明表明，Thermo Scientific Phire Hot Start II DNA Polymerase 在快速端点 PCR 应用中表现优异。通过缩短变性、退火和延伸时间，配合优化 ramp rate，可在保持与标准程序相当的扩增效率和特异性的条件下，大幅压缩扩增时间；对于短片段扩增，结果最短可在约 21 分钟内获得。

对于希望在基因分型、克隆构建和病原相关基础研究中提高 PCR 通量和实验周转速度的科研用户，Phire Hot Start II DNA Polymerase 提供了高效且可靠的选择（仅限科研用途，不适用于诊断程序）。

如需了解 Phire Hot Start II DNA Polymerase 及其在快速 PCR 中的更多应用细节，可通过以下方式获取信息或进行订购：

• 访问 Thermo Fisher Scientific 官网（在站内搜索“Phire Hot Start II DNA Polymerase”或相关货号），下载完整说明书与其他应用资料；
• 联系当地 Thermo Fisher Scientific 销售代表或授权经销商，获取产品报价与配套快速 PCR 方案建议；
• 根据实验设计选择合适的配套耗材，如 dNTP Mix、Nuclease-Free Water、ProFlex PCR System、E-Gel EX 凝胶及 Power Snap Plus 成像系统等。

产品订购信息汇总表。内容包括：

• DNA 扩增相关产品：Phire Hot Start II DNA Polymerase（无色版和绿色版）、dNTP Mix、Nuclease-Free Water、ProFlex PCR System（3 × 32 孔）；
• 琼脂糖凝胶电泳相关产品：E-Gel Sample Loading Buffer、E-Gel 1 Kb Plus Express DNA Ladder、E-Gel EX Agarose Gels（2% 与 1%）、E-Gel Power Snap Plus Electrophoresis System；
  表中列出各产品的规格（如 200 reactions、1 mL、10 gels/pk 等）及对应货号，便于实验室按需选购。