深入洞见同位素奥秘，Orbitrap Isora IRMS 应用案例分享

稳定同位素分析已广泛应用于代谢研究、生物合成、环境科学及食品真实性等领域。然而，传统同位素比值分析通常只能获得化合物整体的同位素组成（Bulk Isotope Ratio），难以进一步解析分子内部不同原子位点的同位素分布。

随着研究不断深入，科研人员越来越关注分子内部同位素信息。例如，在代谢途径研究中，仅知道谷氨酸整体的δ¹³C值已难以满足研究需求，更希望进一步了解不同碳位点的同位素组成，从而解析碳流向、生物合成路径及分子来源。这正是特异位点同位素分析（Position-Specific Isotope Analysis，PSIA）的重要价值所在。

基于新一代 Thermo Scientific™ Orbitrap™ IRMS 平台，我们建立了一套适用于氨基酸的特异位点同位素分析工作流程，并以谷氨酸为例进行了分析，为小分子同位素分析提供了一种新的研究思路。

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一体化工作流程，让同位素分析更高效

Orbitrap IRMS 基于 Orbitrap Isora™ 高分辨率质谱技术，将样品引入、数据采集、校准及数据处理整合为一体化工作流程。

整个分析平台包括：

Thermo Scientific Orbitrap Isora MS

Thermo Scientific Vanquish™ Duo UHPLC 自动进样系统

Thermo Scientific Isotope Discoverer™ 数据处理软件

从样品自动进样、方法开发、数据采集，到数据校准、处理及报告生成，实现完整的同位素分析流程。

其中，Vanquish Duo 采用样品/标准交替进样（Sample/Reference Bracketing）的策略，实现样品与标准物质的自动交替分析，可有效校正长时间测定过程中的仪器漂移，提高δ值计算的稳定性和重复性。与此同时，Isotope Discoverer 软件集成了同位素比值计算、校准及结果可视化功能，大幅简化了数据处理流程。

一次分析，获得多维度同位素信息

Orbitrap IRMS 的突出优势在于，通过同一套工作流程即可获得多个维度的同位素信息，而无需分别建立不同分析方法。

整个分析包括两个互补的实验：

完整分子同位素分析

样品经ESI电离后生成完整的谷氨酸分子离子（[M+H]⁺）。结合先进四极杆技术（AQT）和 Orbitrap 高分辨率准确质量（HRAM）检测，可有效分离目标同位素体与干扰离子，并直接获得完整分子的δ¹³C等整体同位素信息。实验中，在120,000分辨率下可同时分辨多达六种谷氨酸同位素体，为高精度同位素分析提供了可靠的数据基础。

图1.谷氨酸 [M+H]+ 离子在 120,000 Orbitrap 分辨率下的典型质谱图。
从同一谷氨酸采集数据中可分辨出多达六个谷氨酸同位素体比值，包括含 ¹³C、¹⁵N 和 ²H 的同位素体。

特异位点同位素分析

Orbitrap™ IRMS 的另一项优势在于可利用高能碰撞解离（HCD）实现可控碎裂。

谷氨酸分子经MS²裂解后产生特征性亚铵离子（Immonium ion），由于裂解过程中脱除了C1羧基，该碎片保留了C2–C5主链信息。结合高分辨率检测，可有效分离²H与¹³C等质量接近的同位素峰，进一步获得分子内部不同位点的同位素组成。

图2.谷氨酸在MS2模式下的质谱扫描图（70%碰撞能量）

通过比较完整分子与碎片离子的同位素组成，可进一步计算获得：

整体 δ¹³C

整体 δ¹⁵N

整体 δ²H

C2–C5 主链 δ¹³C

C1 羧基 δ¹³C

真正实现从整体同位素分析向特异位点同位素分析的拓展。

图3.分辨率设为 75,000 时两种模式质谱图：A) 全扫描模式下完整谷氨酸离子 [M+H]+  B) MS2裂解模式下的亚铵离子。

高重复性验证方法可靠性

为验证方法的稳定性，该工作流程在5台不同的 Orbitrap Isora™ 质谱仪上完成了8组独立实验。特异位点δ¹³C分析同样表现出良好的重复性，证明该方法不仅能够获得整体同位素组成，还能够稳定、可靠地解析分子内部不同碳位点的同位素信息。

为小分子同位素分析提供新的研究工具

谷氨酸只是这一分析方法的验证案例，更重要的是展示了 Orbitrap IRMS 在特异位点同位素分析方面的潜力。

借助完整分子分析与可控裂解技术相结合，Orbitrap IRMS 将同位素分析从整体水平拓展至分子内部，不仅能够获得更多结构相关信息，还为解析代谢途径、碳源贡献、生物合成机制及分子来源提供了新的研究工具。

未来，该工作流程可进一步拓展至氨基酸、代谢物、天然产物等更多小分子体系，在代谢组学、生物合成研究、食品真实性、环境科学及地球化学等领域展现广阔的应用前景。

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