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赛默飞混合模式色谱柱方法开发指南 (Ⅲ)：两性离子化合物分析新思路
在早前两期文章中，我们围绕赛默飞 Acclaim 系列混合模式色谱柱，系统介绍了其理化性质、保留机制及典型应用，并重点讨论了方法开发中的色谱柱选择与色谱条件优化策略。作为一款兼具反相保留 (RP) 和弱阴离子交换 (WAX) 双重作用的混合模式色谱柱，Acclaim Mixed-Mode WAX-1 在实际应用案例中还表现出显著的 HILIC 保留特征，为两性离子化合物的分析提供了新的方法开发思路。
本期将从这一独特的色谱现象切入，总结两性离子化合物的分离保留规律，并结合分析物理化性质、官能团相互作用及色谱条件优化，进一步探讨 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱在 HILIC 模式下的分离特点与应用潜力。
Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱 HILIC 保留机制探讨
Acclaim Mixed-Mode 系列色谱柱均采用高纯多孔硅胶基质，通过不同键合相结构赋予固定相差异化的选择性[1]。其中，Acclaim Mixed-Mode WAX-1/WCX-1 均具有疏水烷基链，并分别以叔胺和羧基作为端基，在反相 (RP) 保留的基础上兼具弱阴离子交换 (WAX) 或弱阳离子交换 (WCX) 作用[2] [3]。值得关注的是，Acclaim Mixed-Mode WAX-1/WCX-1 除了典型的 RP/IEX 双重保留机制外，在特定条件下还可表现出 HILIC 保留特征。下文将重点以 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 为例，进一步探讨其 HILIC 保留机制与分离特征。
图 1 Acclaim Mixed-Mode 系列色谱柱理化参数 (Bi-modal)
赛默飞经典 HILIC 色谱柱具有丰富的固定相类型，包括裸硅胶、二醇基、氨基、氰基、脲基、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯亚胺(PEI)及磺酸根甜菜碱两性离子等，如图 2 所示。不同固定相虽然化学结构各异，其 HILIC 保留可涉及亲水分配、氢键作用及静电相互作用等多种机制[4]。其中，以 Hypersil GOLD HILIC 为代表的含仲胺官能团线性 PEI 固定相，同时具有亲水作用和阴离子交换特性，表明离子交换 (IEX) 可作为 HILIC 的次级保留作用。基于此，Acclaim Mixed-Mode WAX-1 固定相末端的可电离叔胺官能团除提供 WAX 作用外，也可参与 HILIC 保留，从而呈现 RP/WAX/HILIC 多重保留机制，为强极性化合物提供独特的分离选择性。
图 2 赛默飞多种亲水作用 (HILIC) 色谱柱键合相示意图汇总
Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱 HILIC 模式分离保留规律
在赛默飞实验室设计的验证试验中，丙酸、硝酸根/亚硝酸根和肌酸在 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱上呈现出不同的分离保留规律，如图 3 所示。结合分析物结构及保留特征推测，丙酸主要表现出 RP 保留特征，硝酸根/亚硝酸根主要表现出 IEX 保留特征，而两性离子化合物肌酸则表现出明显的 HILIC 保留特征。上述结果显示，Acclaim Mixed-Mode WAX-1 的多重保留机制在不同分析物上可能具有不同的相对贡献，具体保留行为仍与分析物结构及色谱条件密切相关。
以典型两性离子化合物麦角硫因为例，与 Syncronis HILIC 经典两性离子固定相进行比较。如图 4 所示，随着乙腈比例升高，麦角硫因在两种色谱柱上的保留均明显增强，呈现出相似的 HILIC 保留特征，进一步验证了 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 在两性离子化合物 HILIC 模式分析中的适用性。与传统 HILIC 固定相相比，Acclaim Mixed-Mode WAX-1 具有以下特点：一是兼具 RP/WAX/HILIC 多重保留机制，为两性离子及强极性化合物提供更丰富的分离选择性；二是可耐受高比例水相（最高 100% 缓冲盐水相），兼顾高有机相与高水相条件，有利于提高方法运行稳定性和色谱柱耐用性，并为梯度洗脱及方法开发提供更大的灵活性；三是极低的柱流失，有利于降低背景干扰、提升分析灵敏度，兼容 CAD、ELSD、MSD 等检测器。
图 4 麦角硫因在 Syncronis HILIC 和 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 上的分离保留
尿囊素虽然属于强极性化合物，在 Acclaim Mixed-Mode WAX-1/WCX-1 上均呈现出 HILIC 保留特征，但其保留对有机相比例的响应相对温和，如图 5 所示。与典型两性离子化合物相比，这一现象提示分析物的电离特性可能是影响 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱 HILIC 模式保留及选择性调控的重要因素之一。实际方法开发中，针对不同样品基质，可利用 WAX-1/WCX-1 固定相选择性的差异减少基质干扰，获得互补的分离选择性。尿囊素在两款色谱柱上呈现出的 HILIC 保留特征，也为进一步探索 Acclaim Mixed-Mode WCX-1 的 HILIC 模式提供了新的思路。
图 5 尿囊素在 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 / WCX-1 上的分离保留
Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱 HILIC 模式方法优化思路
在 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱 HILIC 模式的方法开发中，流动相 pH 不仅可能影响色谱柱固定相端基的电离状态，也会改变两性离子化合物自身的电荷状态。固定相多重保留机制 (RP/WAX/HILIC) 与分析物不同电荷状态 (负电荷/电中性/正电荷) 的相互作用，为方法优化提供了更多可能。因此，两性离子化合物的 pKa、pKb 及等电点 pI 与最佳流动相 pH 之间的关系，是值得进一步关注和研究的方向，其普适性仍有待更多实验数据验证。
如图 6–8 所示，L-苯丙氨酸、三七素和麦角硫因在不同流动相 pH 条件下，其色谱保留、峰形及响应均呈现出不同程度的变化。其中，L-苯丙氨酸具有明确的 pKa、pKb 和 pI 信息，可为进一步探索上述关系提供参考。
图 6 不同流动相 pH 下，L-苯丙氨酸在 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 上的峰形及响应
图 7 不同流动相 pH 下，三七素在 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 上的峰形及响应
图 8 不同流动相 pH 下，麦角硫因在 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 上的峰形及响应
两性离子化合物的结构与类型
常见两性离子化合物的分类
两性离子化合物通常同时含有酸性和碱性可电离基团，在一定 pH 条件下可形成分子内正、负电荷共存的两性离子形式，整体净电荷可为零。根据酸性和碱性官能团的相对强弱，可分为强酸强碱、强酸弱碱、弱酸强碱和弱酸弱碱四类。不同官能团组合使化合物具有不同的 pKa、等电点(pI)及净电荷随 pH 的变化规律，并进一步影响其溶解性、亲水性及色谱行为。
图 9 常见两性离子化合物的结构式及分类
21 种氨基酸 21 Amino Acids（弱酸弱碱）
氨基酸含有氨基和羧基，在一定 pH 条件下以两性离子形式存在。根据侧链结构和性质，可分为带电荷侧链、极性不带电侧链、疏水侧链及特殊结构等类型[5]。氨基酸广泛应用于细胞培养基、蛋白及多肽药物等，其准确检测对于生物制药工艺监测与质量控制具有重要意义。
图 10 21 种氨基酸的结构式及分类
12 种 Good's 缓冲剂 12 Good's Buffers（强酸弱碱/弱酸弱碱）
Good's 缓冲剂是由 Norman Good 等提出的一类生物缓冲化合物，通常具有适宜的 pKa、高水溶性、低生物毒性及较低紫外吸收等特点。多数 Good's 缓冲剂具有较强亲水性，并可呈现两性离子形式[6]，广泛应用于蛋白质、单克隆抗体等生物制药相关体系，其准确检测对于工艺研究与质量控制具有重要意义。
图 11 12 种 Good's 缓冲剂的结构式及缓冲范围
Acclaim Mixed-Mode WAX-1 色谱柱 HILIC 模式行业应用案例
基于上述 HILIC 保留机制及方法开发思路，Acclaim Mixed-Mode WAX-1 已进一步拓展至多种两性离子化合物的分析，应用涵盖食品及保健食品、化妆品及个人护理产品、中药材及饮片、化学制药和生物制药等多个领域。下面将结合实际样品与典型化合物，分享 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 在 HILIC 模式下的部分应用案例。
1 食品及保健食品
图 12 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于 γ-氨基丁酸的测定 (CAD)
图 13 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于肌酸的测定 (DAD)
图 14 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于麦角硫因的测定 (DAD)
2 化妆品及个人护理产品
图 15 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于 L-肌肽的测定 (DAD)
图 16 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于乙酰基四肽-2 的测定 (DAD)
图 17 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于乙酰基八肽-3 的测定 (DAD)
3 中药材及饮片
图 18 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于益母草颗粒中盐酸水苏碱含量的测定 (CAD)
图 19 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于枸杞子中甜菜碱含量的测定 (CAD)
图 20 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于三七中三七素含量的测定 (DAD)
4 化学制药
图 21 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于牛磺酸的测定 (CAD)
图 22 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于 L-苯丙氨酸的测定 (DAD)
图 23 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于 L-半胱氨酸和 L-胱氨酸的测定 (DAD)
5 生物制药
图 24 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于 6 种氨基酸的分离 (DAD)
图 25 Acclaim Trinity P1 应用于 L-精氨酸盐酸盐的测定 (CAD)
图 26 Acclaim Mixed-Mode WAX-1 应用于 3-(N-吗啡啉)丙磺酸含量测定 (DAD)
图 27 Acclaim Trinity P2 应用于 10 种 Good’s Buffer 的测定 (CAD)
Acclaim Mixed-Mode 系列色谱柱键合相描述
- Acclaim Mixed-Mode WAX-1 带有可电离叔胺端基的疏水烷基链键合硅胶
- Acclaim Mixed-Mode WCX-1 带有可电离羧基端基的疏水烷基链键合硅胶
- Acclaim Mixed-Mode HILIC-1 带有二醇基端基的疏水烷基链键合硅胶
- Acclaim Trinity P1 色谱柱填料为聚合物微球杂化多孔硅胶颗粒 (3 μm)，硅胶内孔区键合相为具有弱阴离子交换和反相保留 (WAX/RP) 官能团，聚合物外表面键合相为具有强阳离子交换 (SCX) 官能团
- Acclaim Trinity P2 色谱柱填料为聚合物微球杂化多孔硅胶颗粒 (3μm)，硅胶内孔区键合相为具有弱阳离子交换和亲水作用 (WCX/HILIC) 官能团，聚合物外表面键合相为具有强阴离子交换 (SAX) 官能