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AFASI-Orbitrap直击ESI微液滴伪影，破解代谢组“暗峰”难题
未知代谢物离子来源、身份与结构的可靠注释，一直是质谱代谢组领域长期存在的技术难题。质谱学界提出“代谢暗物质”（metabolic dark matter）或“暗代谢组”（dark metabolomics）的概念，指代那些现有数据库难以注释与鉴定的未知小分子物质，这些物质既有来源于生物样本但无法确证的真实代谢物，也有电离过程引入的次生离子（即假阳性代谢物或伪代谢物）。
相较于电子轰击离子化（Electron Impact, EI），电喷雾离子化（Electrospray Ionization, ESI）一直被认为是一种极软的电离方式，除目标分子离子以外，仅存在少量源内裂解碎片离子，以及来源于溶剂、管路、器皿等杂质与背景离子。随着质谱检测灵敏度、质量分辨率与采集效率的提升，电喷雾微液滴的自由基氧化还原、惰性键活化、能垒降低与反应加速等气液界面理化特性，被逐渐认识。ESI过程中的微液滴阶段会引发远超预期的暗化学反应，生成许多现有数据库无法注释的离子，这即对离子来源的准确识别造成严重干扰，也增加了真实未知代谢物离子的注释难度。
近日，中国医学科学院药物研究所再帕尔·阿不力孜教授团队联合斯坦福大学Richard N. Zare教授团队，在《ACS Measurement Science Au》发表研究论文，首次系统揭示ESI过程产生的微米级液滴气-液界面，会引发代谢物之间发生次生反应，生成大量低丰度的伪代谢物离子和假阳性代谢物离子。团队系统解析了微液滴六个典型的暗反应路径，开发了次生离子的预测与自动识别程序，构建了新型气流辅助喷雾电离装置（Air Flow Assisted Spray Ionization, AFASI），从电离源头减少伪代谢物和假阳性代谢物离子产生，搭配赛默飞 Orbitrap 高分辨质谱实现暗离子精准识别与暗反应的大幅抑制，显著提升代谢物离子来源识别的准确度和注释可信度。
自动注释程序：
大幅提升代谢物离子的准确识别率
研究系统总结了ESI中可能发生的多种微液滴次生反应（氧化还原、脱羧偶联、自由基加成、还原胺化等），甚至氮气雾化气、甲醇、乙腈流动相溶剂也会参与到亚硝基化、甲基化、乙酰化反应造成假阳性代谢修饰，容易被误认为是新的代谢物。以对氨基苯甲酸为例，相较于源内碎裂（in-source CID），电喷雾微液滴反应进度和次生离子强度，会随着喷针到质谱进样口的距离延长而增强，表明很多"未知峰"是在液滴飞行过程中逐渐形成，而不仅是进入质谱以后通过裂解产生。
基于已知代谢物结构和微液滴反应规则，团队自建了次生反应产物离子的预测算法，根据不同微液滴暗反应生成的次生离子结构和质量偏移不同，实现了次生离子预测与自动识别、注释程序（已开源），其工作流程如下：输入已标注代谢物的名称或SMILES结构编码信息→根据代谢物结构预测可能的微液滴次生反应→计算理论产物分子量与离子精确质荷比→与实测离子匹配→输出注释结果。
Orbitrap质谱实测验证暗离子
为验证该程序，研究在正离子模式下使用ESI-MS检测由70种已知代谢物组成的混合溶液，扣除常见背景离子和强度低于102的随机噪音离子后，共检出1744个离子，其中仅113个（5.3%）为真实代谢物的质子/钠加合峰，使用自动注释程序，成功识别了 978个次生离子，未知暗离子的注释率提升至56%（按总离子强度计超91%）。依托赛默飞 Orbitrap 超高分辨、高质量精度优势，可精准区分真实代谢物与质量偏差极小的伪代谢物离子，从而避免了未知代谢物离子的假发现率。该程序同样适用于纳升电喷雾（nESI）、解吸电喷雾（DESI）、纸喷雾（PSI）等多种涉及喷雾微液滴过程的电离技术。
图1 几种喷雾电离源的微液滴次生暗离子占比及其自动识别与标注情况
AFASI装置：从源头抑制次生暗离子产生
尽管自动注释程序提升了未知离子来源、身份的准确识别与注释，但是更理想的策略是从电离源头直接抑制这些次生离子的产生。为此团队设计了气流辅助喷雾电离（air-flow-assisted spray ionization, AFASI）装置，其主要改进在于将 ESI 电离源、质谱仪进样口与真空泵相连形成一个密封腔室，采用更加惰性的氩气替代氮气作为雾化气体，在传输管内的真空梯度驱使下，喷雾微液滴可以瞬时蒸发电离，有效减少了其存在周期，以及代谢物在微液滴气-液界面上的反应时间。
实验表明，AFASI装置可将次生离子强度降至1×102水平甚至更低，次生离子的总强度占比被压低至10%以内，同时仍能保持目标代谢物的全面检出。进一步参数优化表明，降低喷雾电压、缩短微液滴存在周期、使用无水溶剂和惰性气体氛围，是减少次生离子产生的有效策略。AFASI装置不仅可在无外加喷雾电压下完成代谢物离子检测，还支持远距离采样，该装置亦搭载于AFADESI-Orbitrap质谱成像系统。
图2 AFASI最大限度降低暗离子数量和强度水平，保证代谢组离子的生物来源真实性
AFASI-Orbitrap提升代谢组学暗物质解析
AFADESI-Orbitrap系统搭载了本研究开发的AFASI电离装置，能够大幅减少假代谢物离子产生，同时支持质谱成像功能，为空间代谢组学相关研究可提供更可靠的数据基础和更便捷的操作方案。对于代谢组学而言，理解电喷雾微液滴中的界面化学反应，不仅有助于解释长期困扰的"暗代谢物"现象，也为保证未知离子来源与身份的准确识别、离子注释率的显著提升、假阳性代谢物离子检测结果、优化液质联用实验方法提供了新的思路。
AFADESI可搭载赛默飞Orbitrap超高分辨质谱全平台