基于近红外优化 Cell Painting 的 CRISPR p53 敲除 A549 细胞表型解析——CellInsight CX7 LZR Pro 应用实践

引言

肿瘤蛋白 53（tumor protein 53，p53）是维持细胞稳态和基因组完整性的核心抑癌蛋白。p53 通过调控细胞周期、启动 DNA 修复以及在损伤不可逆时诱导凋亡，防止异常细胞继续增殖。若 p53 基因发生突变，导致蛋白功能丧失或显著削弱，细胞将更易累积突变并进而发生恶性转化，据报道约有 50% 的癌症与 p53 基因突变直接或间接相关。

 

Cell Painting 作为一种多通道荧光标记的形态学表型成像技术，已广泛用于基因敲除、药物处理或环境刺激下的细胞状态描绘和多参数定量分析。通过对细胞核、细胞骨架、内质网、线粒体等结构的系统性染色和高内涵成像，Cell Painting 能捕获传统单靶点实验难以观察的细微表型变化。

应用背景：解决 Cell Painting 中的光谱重叠问题

经典 Cell Painting 方案中，部分染料在光谱上存在较强重叠，会影响高内涵分析平台对特定结构的定量精度：

  • 绿色通道：SYTO 14™ 与 Concanavalin A–Alexa Fluor™ 488 共用；
  • 橙色通道：Wheat Germ Agglutinin–Alexa Fluor™ 555 与 Alexa Fluor™ 568 Phalloidin 光谱相近。

这会导致：

  • RNA、核仁以及内质网（ER）的信号难以在绿色通道中准确分离；
  • 质膜、高尔基体和肌动蛋白（actin）在橙色通道中的定量也受到干扰。

随着近红外（near-infrared, NIR）标记试剂和成像平台的发展，如果能将部分标记迁移至 NIR 通道，就有机会显著降低通道间光谱串扰，提升 Cell Painting 的分辨率与定量线性。

 

Thermo Scientific™ CellInsight™ CX7 LZR Pro 平台具备 NIR 检测能力，配合专门优化的 NIR 试剂，能够在不增加采集复杂度的前提下改善通道分离。本应用案例即通过对 Invitrogen™ Image-iT™ Cell Painting Kit 进行小幅改造，实现对 CRISPR p53 敲除 A549 细胞与野生型细胞的表型对比分析。

实验方法与结果

CRISPR/Cas9 构建 p53 敲除 A549 细胞

细胞系构建流程

  • 细胞系：A549 肺腺癌细胞。
  • Cas9 表达：
    • 使用 Invitrogen™ LentiArray™ Cas9 Lentivirus 转导 A549 细胞；
    • 随后加入 blasticidin 筛选，去除未表达 Cas9 的细胞。
  • gRNA 转染：
    • 共设计 4 条 gRNA，靶向 p53 基因的第 2、4、5 外显子；
    • 采用 Invitrogen™ Neon™ Transfection System 电转导入；
    • 同时电转一组非靶向 scramble gRNA 作为野生型（scramble）对照群体。
  • 单细胞克隆：通过单细胞分散培养获得基因型一致的细胞群体。

p53 敲除验证

  • 使用 p53 一抗和 Alexa Fluor™ 488 标记的二抗进行免疫荧光染色；
  • 在 CellInsight™ CX7 LZR Pro 平台上采集图像并量化荧光信号；
  • 与未标记 p53 的野生型细胞相比，信号无显著差异的细胞群体定义为 p53 完全敲除（KO）。

NIR 优化的 Cell Painting 实验设计

细胞接种与药物处理

  • 板型设计：96 孔板
    • 上 4 行：A549 p53 KO 细胞，每孔 5,000 个细胞；
    • 下 4 行：A549 野生型（scramble）细胞，每孔 5,000 个细胞。
  • 培养：标准细胞培养条件下孵育过夜。
  • 药物处理（½ log 剂量梯度）：
    • Cytochalasin D：孵育 3 小时；
    • Etoposide：孵育 20 小时；
    • Staurosporine：孵育 4 小时。

Cell Painting 染色方案调整

在 Invitrogen™ Image-iT™ Cell Painting Kit 的基础上做了两处关键修改，以充分利用 NIR 通道并减少光谱重叠：

  1. 使用 Alexa Fluor™ 594 Phalloidin 替代 Alexa Fluor™ 568 Phalloidin；
  2. 使用 Concanavalin A–Alexa Fluor™ 750 Plus conjugate 替代 Concanavalin A–Alexa Fluor™ 488 conjugate，将其信号迁移至 NIR 通道。

这样可以：

  • 减少绿色通道中 RNA/核仁信号与 ER 标记的干扰；
  • 改善 actin、质膜和高尔基体在可见光通道中的分离度；
  • 保持其它 Cell Painting 核心组分不变，便于用户从标准试剂盒平滑迁移到 NIR 版本。

关键结果与表型差异解析

总体表型变化与肌动蛋白结构

  • p53 KO 细胞在所有 Cell Painting 靶标上均表现出与野生型显著不同的表型；
  • 其中最明显的差异之一是 肌动蛋白纤维数量减少：
    • Actin 斑点（spot）计数显著低于野生型，提示细胞骨架结构发生重构；
    • 可能与 p53 缺失导致的细胞迁移、粘附和形态调控紊乱相关。

Etoposide 处理下的 RNA 与内质网响应

Etoposide 是经典的拓扑异构酶抑制剂，可诱导 DNA 损伤并激活 p53 相关通路。该实验中：

  • 胞质 RNA 含量
    • p53 KO 细胞在 Etoposide 处理后，胞质 RNA 信号较对照显著降低；
    • 与野生型相比，RNA 强度随浓度增加出现更早、幅度更大的下降。
  • 内质网（ER）结构
    • ER 染色强度在 p53 KO 细胞中同样更快下降；
    • 野生型细胞在相同浓度下则呈现相对缓和的变化。
  • 线粒体膜电位（mitochondrial spot intensity）
    • 在 p53 KO 细胞中呈现“先下降后回升”的趋势；
    • 野生型细胞则表现出相反的剂量反应模式。

NIR 优化带来的直接收益是：

  • 将 Concanavalin A 信号移至 NIR 通道后，RNA 与 ER 的量化曲线更加平滑、分离度更高；
  • 使得 etoposide 诱导下的精细表型差异可以被更准确地捕获和统计。

Cytochalasin D 诱导的 actin 去聚合敏感性差异

Cytochalasin D 是抑制 actin 聚合的经典小分子，可用于评估细胞骨架稳定性。实验结果显示：

  • 在低至中等浓度区间，p53 KO 细胞的 actin 纤维较野生型更早解聚；
  • actin spot 数量剂量反应曲线显示：
    • p53 KO 细胞的 EC50 明显 左移超过 2 log 单位；
    • 表明在相同暴露条件下，p53 缺失细胞对 actin 去聚合更为敏感。

这一结果从细胞骨架层面再次支持了 p53 对细胞形态和结构稳态具有重要调控作用。

 

Staurosporine 诱导的凋亡相关表型

Staurosporine 是广泛使用的蛋白激酶抑制剂，可诱导细胞凋亡。结果表明：

  • 对线粒体斑点强度和胞质 RNA 的影响趋势在 p53 KO 和野生型细胞之间基本一致；
  • 未观察到类似 Cytochalasin D 或 Etoposide 那样的显著差异。

说明在本实验条件和指标下，Staurosporine 诱导的表型变化对 p53 状态的依赖性相对较弱。

应用场景（基于原文内容的合理延展）

结合本案例，NIR 优化 Cell Painting 方案与 CellInsight™ CX7 LZR Pro 平台可用于：

  • 基因功能研究与通路解析
    • 系统比较野生型与基因敲除/敲低细胞的形态学差异；
    • 评估 p53 等关键基因失活对细胞骨架、细胞器和代谢状态的影响。
  • 药物筛选与作用机制研究
    • 在多参数维度表征候选化合物对不同基因背景细胞的敏感性；
    • 区分 p53 依赖型与非依赖型药物反应模式，为靶点机制研究提供线索。
  • 毒性评估与安全性表征
    • 利用形态学指纹快速识别潜在毒性信号，如线粒体损伤或 ER 应激；
    • 与传统活性与毒性读数（如 ATP、细胞活力）互补。
  • 表型筛选与药物重定位
    • 构建化合物诱导的细胞表型数据库，比对不同处理条件下的表型相似性；
    • 发现具有类似“p53 恢复”或“p53 缺失”表型特征的小分子候选物。

优势亮点

方法学优势

  • NIR 通道减少光谱重叠
    • 通过将 Concanavalin A 标记迁移至 Alexa Fluor™ 750 Plus，显著降低绿色通道串扰；
    • 提升 RNA、核仁和 ER 等结构的定量精度。
  • 保持与标准 Image-iT™ Cell Painting Kit 的兼容性
    • 仅需更换两种染料，即可平滑升级为 NIR 优化版本；
    • 有利于已建立标准 Cell Painting 流程的实验室快速迁移。

平台与应用优势

  • CellInsight™ CX7 LZR Pro 高内涵平台
    • 支持多激光、多通道成像及 NIR 检测；
    • 搭配图像定量分析软件，可快速提取数百个形态学特征。
  • 适配 CRISPR 基因编辑模型
    • 可与 CRISPR/Cas9 敲除、gRNA 文库筛选等技术结合，用于系统性表型筛选；
    • 本案例通过 LentiArray™ Cas9 与 Neon™ 电转系统实现稳定、高效的基因编辑流程。

订购信息

原文提供的订购信息包括但不限于：

  • CellInsight CX7 LZR Pro HCS Platform – Cat. No. HCSDCX7LZRPRO
  • Neon NxT Electroporation System – Cat. No. NEON1S
  • Image-iT Cell Painting Kit – Cat. No. I65000
  • Alexa Fluor 594 Phalloidin – 300 units, Cat. No. A12381
  • Concanavalin A–Alexa Fluor Plus 750 conjugate – 1 mg × 5 vials, Cat. No. C56127
  • LentiArray Cas9 Lentivirus – 100 µL, Cat. No. A32064
  • Neon Transfection System 100 μL Kit – Cat. No. MPK10025

For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.

小结

本应用案例表明：

  • 通过在 CellInsight™ CX7 LZR Pro 平台上采用 NIR 优化的 Cell Painting 方案，可有效缓解传统染料组合带来的光谱重叠问题；
  • CRISPR p53 敲除 A549 细胞在静息及多种药物处理条件下表现出显著的形态学与功能差异，尤其是在 actin 结构、胞质 RNA 含量、ER 强度与线粒体膜电位等指标上；
  • 这种多参数表型读数有助于理解 p53 在维持细胞结构和应激响应中的关键作用，并为新药筛选和机制研究提供更丰富的信息。

通过适当优化试剂组合和检测通道，Cell Painting 不仅可以作为表型成像工具，更可成为连接基因型、药理作用与细胞功能表型的高内涵桥梁。